育肥猪粪便菌群结构及其与生长速度的相关性分析

姜长津，陈 云，潘鹏丞，陈宝剑，关志惠，卢慧林，谢炳坤，覃兆鲜

(1.广西大学动物科学技术学院，南宁 530004；2.广西壮族自治区畜牧研究所，广西家畜遗传改良重点实验室，南宁 530001)

长期以来，因抗生素不规范使用导致细菌产生耐药性、动物免疫力下降产生对药物的依赖性，以及畜禽产品中药物残留也会直接危害人体健康等问题日益突显[1]，为了人与自然可持续发展，中国开始全面实施禁抗令。由于畜禽饲料中禁止添加抗生素、抗菌生长剂，因此肠道微生物多样性与宿主生产性能之间的关系变得更为重要。遗传因素是动物表型性状最重要的决定因素，而肠道微生物作为一个额外因素，与宿主之间有着紧密的互作关系，可以肠道微生物结构多样性作为指示来改善生长性能[2]。肠道微生物被认为是第二基因组，与动物的生命过程息息相关，与动物机体相互作用，在利用日粮能量的同时将饲粮中粗纤维等机体自身难以消化的能量物质进行发酵分解，为机体提供能量[3-4]。在猪生产中，即使是相同条件下饲养的同批次、同品种猪，在生长速度上也会存在显著差异，这与后天生长发育过程中肠道菌群的定植有着重要联系[5]。 16S rRNA高通量测序技术的发展与应用，推动了对肠道菌群结构与功能研究的进程[6]。目前，肠道微生物的研究已经成为热点，但大多数是对生长猪初期阶段肠道微生物结构组成及功能的研究[7-8]，而对生长育肥猪中后期阶段不同生长速度猪的肠道菌群研究较少。鉴于此，本研究对125日龄不同生长速度的猪进行粪便微生物多样性研究，以期寻找与生长速度密切相关的菌群。

1 材料与方法

1.1 动物饲养与样品采集

选用由广西壮族自治区畜牧研究所种猪场提供的杜洛克猪与陆川猪杂交得到杜陆猪，选择同日出生、体重相近的仔猪50头，于相同环境中饲养，试验期间未转入新猪，所有饲料和饮水均未添加抗生素，对生病猪及时淘汰出试验组。125日龄时，对所有试验猪称重并采集粪便样本，置于冻存管中，-80 ℃保存备用。按体重高、低进行排序，选择体重最高的4头猪作为HW组，体重最低的4头猪作为LW组，两组猪体重与平均日增重均差异极显著(表1)，对两组猪粪便样品进行微生物区系分析。

表1 HW和LW组猪体重与平均日增重

1.2 16S rRNA基因测序

使用TGuideS96磁珠法土壤/粪便基因组DNA提取试剂盒提取猪粪便微生物DNA，根据保守区选择16S rRNA基因V3-V4区进行扩增，引物序列为：338F：5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′，806R：5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′，扩增目的区间长度约为470 bp。PCR反应体系10 μL：模板DNA 10 ng，上、下游引物(10 μmol/L)各0.3 μL，KODFX Neo Buffer 5 μL，dNTP(各2 mmol/L) 2 μL，KODFX Neo 0.2 μL，ddH2O补足体系。PCR扩增程序：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，共25个循环；72 ℃延伸7 min；4 ℃保存。PCR扩增产物经1.8%琼脂糖凝胶电泳检测，对鉴定正确的PCR产物进行纯化、定量和均一化形成测序文库，建好的文库先进行文库质检，质检合格的文库用Illumina Novaseq 6000进行测序，对测序数据进行质控。基于97%相似度进行聚类分析，在OTU水平上进行稀释曲线分析。

1.3 粪便菌群区分分析

对测序数据使用Trimmomatic v 0.33软件进行质量过滤，使用Usearch v 10.0软件双端序列拼接，使用UCHIME v 4.2软件去除嵌合体后得到有效序列信息，将得到的有效序列进行聚类，获得OTU。基于聚类分析结果进行Alpha多样性分析(Ace、Chao1、Simpson、Shannon、PD、Coverage指数)，使用QIIME进行主成分分析、显著物种差异等分析。

1.4 统计分析

数据经Excel进行初步整理后，使用SPSS 25.0软件进行单因素方差分析(One-Way ANOVA)，使用t检验进行组间差异分析，对丰度前30的菌群进行斯皮尔曼(Spearman)秩相关分析，并筛选出相关性>0.1且P<0.05的菌群。结果以平均值±标准误表示，P<0.05表示差异显著。

2 结 果

2.1 PCR扩增与数据质控分析

由Sob和Shannon稀释曲线可以看出，当样品随机抽取数量达8 000时曲线逐渐趋于平缓，稀释曲线最终均达到平台期(图1)，表明测序深度符合后续试验要求。

2个试验组共得到有效序列598 053个，其中HW组有296 761个有效序列，LW组有301 292个有效序列。2个试验组共获得943个OTUs，其中共有OTUs为828个，HW组特有OTUs为61个，LW组特有OTUs为54个(图2)。

2.2 猪粪便菌群Alpha多样性分析

对HW和LW组所有样本进行Ace、Chao1、Simpson、Shannon、PD、Coverage指数分析，之后对组间指数进行t检验，结果显示，HW和LW组间Alpha多样性差异均不显著(P>0.05;表2)。

2.3 猪粪便菌群主成分分析

对HW和LW组所有样本进行主成分分析，结果显示，在门水平(图3A)和属水平(图3B)HW和LW组菌群结构完全分开，同一日龄不同体重的两组猪中，粪便菌群结构出现明显的差异。

图1 Sob(A)和Shannon(B)稀释曲线Fig.1 Sob (A) and Shannon (B) rarefaction curves

图2 粪便菌群OTU水平物种Venn图Fig.2 Venn diagram of OTU level species in HW and LW groups

表2 Alpha多样性指数分析

图3 粪便菌群门水平(A)和属水平(B)主成分分析图Fig.3 PCA chart of the fecal flora at the phylum (A) and genus (B) levels

2.4 猪粪便菌群组成及差异分析

对HW和LW组所有样本进行分类学分析，共检测到门水平17个，纲水平30个，目水平58个，科水平120个，属水平271个，种水平302个。HW和LW组共有16个(94.12%)门(图4A)，其中厚壁菌门(Firmicutes，在HW和LW组分别占比62.07%和60.69%)、拟杆菌门(Bacteroidetes，在HW和LW组分别占比13.41%和25.38%)、螺旋体门(Spirochaetes，在HW和LW组分别占比15.45%和8.80%)为主要优势菌门，检测到热袍菌门(Thermotogae)为LW组特有菌门(图4B)，但在LW组中占比极小。HW和LW组厚壁菌门与拟杆菌门的占比分别为4.62%和2.39%，HW组的比值高于LW组。通过t检验对体重高、低组进行差异菌群分析，共发现3个差异菌门，分别是拟杆菌门、纤维杆菌门(Fibrobacteres)和髌骨细菌门(Patescibacteria)。LW组拟杆菌门丰度极显著高于HW组(P<0.01)，纤维杆菌门丰度显著高于HW组(P<0.05)，而髌骨细菌门丰度则显著低于LW组(P<0.05)。螺旋体门(Spirochaetes)在HW组(15.45%)中的丰度高于LW组(8.8%)，但差异不显著(P>0.05)。

A，Venn图；B，条形图。下同A,Venn diagram;B,Bar plots.The same as below图4 门水平HW和LW组猪粪便菌群组成Fig.4 Compostion of the fecal flora in HW and LW groups pigs at the phylum level

在属水平上，HW和LW组共有菌属231个(85.24%)，HW和LW组特有菌属分别有16和24个(图5A)。 HW组优势菌属为密螺旋体属(Treponema_2，15.60%)、乳杆菌属(Lactobacillus，10.97%)和链球菌属(Streptococcus，5.82%)，LW组优势菌属为不可培养菌属_f_Muribaculaceae(19.19%)、乳杆菌属(14.71%)和密螺旋体属(8.91%)。使用t检验对属水平进行差异菌属分析，得到16个差异显著菌属(图5B)。其中，HW组中优势菌属密螺旋体属是LW组的1.75倍，但差异不显著(P>0.05);而HW组中链球菌丰度显著高于LW组(P<0.05);LW组中优势菌属不可培养菌_f_Muribaculaceae丰度极显著高于HW组(P<0.01);其他丰度较低的菌属，如Ruminiclostridium_9和瘤胃菌科_UCG-014(Ruminococcaceae_UCG-014)在HW组中的丰度极显著高于LW组(P<0.01)；HW组中毛螺菌科NK4A136组(Lachnospiraceae_NK4A136__group)的丰度极显著高于LW组(P<0.01)。

图5 属水平HW和LW组猪粪便菌群组成Fig.5 Compostions of the fecal flora in HW and LW groups pigs at the genus level

2.5 猪肠道微生物与生长速度的关联分析

选取丰度前30的菌群与体重、平均日增重进行相关性分析，在门水平上共发现10个菌门与体重、平均日增重呈正相关，7个菌门呈负相关，其中Patescibacteria和螺旋体门与体重、平均日增重之间呈显著正相关(P<0.05)，而纤维杆菌门呈极显著负相关(P<0.01)(图6A)；在属水平上共发现18个菌属与体重、平均日增重呈正相关，12个菌属呈负相关，瘤胃菌科UCG-008(Ruminococcaceae_UCG-008)、瘤胃菌科UCG-014(Ruminococcaceae_UCG-014)和密螺旋体属(Treponema_2)呈显著正相关(P<0.05)(图6B)。

①A，门水平；B，属水平。②*，差异显著(P<0.05)；**，差异极显著(P<0.01)①A,Phylum level；B，Genus level.②*，Significant difference (P<0.05);**，Extremely significant difference (P<0.01)图6 HW和LW组猪粪便菌群与生长速度相关性热图Fig.6 Heat map of correlation between the fecal flora and the growth rate in HW and LW groups pigs

3 讨 论

肠道微生物在产生维生素、酶和其他化合物方面起着重要作用，这些化合物在食物消化和代谢中发挥着重要作用[9]。肠道菌群多样性对宿主是有利的[10-11]。Han等[12]研究表明，高体重组Alpha多样性(OTU观察值及Ace、Chao1、PD、Shannon和Simpson指数)高于低体重组，与本试验高体重组Alpha多样性指数高于低体重组的趋势相同。何贝贝等[13]研究发现，与低体重猪相比，高体重猪的Shannon指数呈现增长的趋势。Cui等[14]研究发现，仔猪平均日增重和平均日采食量降低时，肠道微生物区系的丰富度和多样性反而增加。以上结果表明，Alpha多样性与体重增加之间的关系较为复杂，可能受遗传和环境的众多因素影响而表现出不同的结果，但更多的研究结果偏向于菌群多样性对宿主健康生长起到积极的作用。

在门水平上，高、低体重组平均日增重的优势菌群均为厚壁菌门、拟杆菌门和螺旋体门，但两组间拟杆菌门存在显著差异，这与陈宝剑等[15]研究结果相吻合。Ban-Tokuda等[16]研究发现，拟杆菌门与血浆瘦素呈显著相关，拟杆菌门可能通过影响体内脂肪堆积从而影响体重，且随着体重的增加，拟杆菌门丰度下降，厚壁菌门丰度上升。Murphy等[17]研究显示，厚壁菌门可能通过促进淀粉等的代谢及丁酸等短链脂肪酸的生成为机体提供更多的营养物质，而丁酸对肌肉脂肪组织和体重的增加有一定促进作用[18]。徐娥等[19]研究表明，大约克猪肠道中的厚壁菌门可能与饲粮中淀粉多糖和蛋白质的消化有关。本试验中，高体重组拟杆菌门丰度显著低于低体重组，厚壁菌门丰度高于低体重组，与前人研究结果趋势一致。Guo等[20]研究表明，拟杆菌门与体重呈显著负相关，与本研究中拟杆菌门与体重、平均日增重呈负相关的趋势一致，高体重组厚壁菌门与拟杆菌门的比值高于低体重组。

在属水平上，高体重组密螺旋体属丰度高于低体重组，密螺旋体能够分解饲粮中宿主难以分解的多糖，猪饲粮中难以消化的粗纤维主要在大肠中通过菌群发酵[21]，为机体提供此部分的能量，这可能是密螺旋体与体重、平均日增重呈正相关的原因，然而大多对密螺旋体的研究都显示其为有害菌，与生长性能呈负相关[22]，因此，对密螺旋体还需进行更深入、广泛的研究。Tang等[23]研究发现，瘤胃菌属与体重、日增重呈极显著正相关，高体重组中瘤胃菌属UCG-014(Ruminococcaceae_UCG-014)和瘤胃菌属UCG-013(Ruminococcaceae_UCG-013)丰度均极显著高于低体重组。Angelakis等[24]研究表明，乳酸杆菌对体重增加有负面影响，这与本试验结果相同，乳杆菌与体重、平均日增重呈负相关。但也有研究得到相反的结果，即乳杆菌与平均日增重呈正相关[25]，这可能是由于乳酸菌基因组可以产生大量的脂肪酶和硫解酶基因，这些基因通过β-氧化来调动脂肪酸中的能量和碳。不同类型乳杆菌对碳水化合物代谢作用的不同导致体重产生差异，与体重减轻有关的乳杆菌其基因组可以编码与果糖、甘露糖、淀粉和蔗糖代谢有关的几种蛋白质，而与体重增加相关的乳杆菌基因组不编码这些蛋白质。由于不同菌株在代谢途径上有较大的差异[26]，这可能是对体重产生不同影响的原因。

4 结 论

高、低体重组猪粪便微生物群落中Alpha多样性不显著，125日龄杜陆猪的优势菌群为厚壁菌门、拟杆菌门和螺旋体门，高体重组厚壁菌门与拟杆菌门的比值高于低体重组，核心优势菌属为乳杆菌属和螺旋体属。对丰度前30的菌群相关性分析发现，有10个菌门、18个属与体重、平均日增重呈正相关，7个菌门、12个属与体重、平均日增重呈负相关。