中畜草原白羽肉鸭与樱桃谷鸭的遗传差异分析

于思梦，郭占宝，胡 健，周正奎，侯水生

(中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，农业农村部动物遗传育种与繁殖(家禽)重点实验室，北京 100193)

肉鸭产业是中国第三大肉类产业，是中国畜牧业的重要组成部分。中国鸭品种资源丰富，其中，北京鸭以其体型大、生长速度快、饲料转化率高、产蛋性能好等特点成为培育肉鸭新品种的理想材料[1]。英国樱桃谷农场以中国北京鸭品种资源为基础，经科学选育后，育成了瘦肉型白羽肉鸭品种——樱桃谷鸭，该品种生长速度快、饲料转化率高，但其皮脂率较高，风味物质沉积能力差[2-3]，近年来，为了满足中国居民肉鸭消费需求，丰富中国肉鸭品种结构，中国农业科学院北京畜牧兽医研究所自主培育了瘦肉型肉鸭品种中畜草原白羽肉鸭。中畜草原白羽肉鸭与樱桃谷鸭均是以北京鸭资源群体为基础选育，但又形成了各自特色。研究2个品种的遗传差异，有望揭示人工选择的遗传变异机制。

鸭具有生长快、世代间隔短，繁殖能力强等生物学特性[4-5]；且基因组小、重测序成本相对较低，是研究家养动物人工选择信号的理想模型。基因组测序技术的发展和应用为遗传育种研究提供了强有力的技术支撑[5-6]。目前，选择信号分析已成为解析物种驯化和人工选择印迹的重要方法，且在多种家养动物中得到了有效利用，鉴定出了一批重要性状候选基因。如Li等[7]通过对藏猪和中国地方猪种进行全基因组重测序，结合群体遗传分化指数(Fst)与群体核酸多样性(θπ)选择信号分析方法鉴定了一系列与缺氧、嗅觉、能量代谢和药物反应相关的基因，揭示了地方猪种在几千年的驯化与人工选择过程中基因组重要经济性状相关基因的进化方向。Zhang等[8]对19个世代的肉鸡腹脂双向选择系进行群体重测序，结合Fst分析确定了参与脂肪形成重要信号通路的基因，包括非经典前折叠素RPB5相互作用因子1(URI1)、甘露糖结合凝集素2(MBL2)、乙酰胆碱转移酶(CHAT)、前蛋白转化酶枯草溶菌素1(PCSK1)处于强选择状态。在鸭中，Fst结合全基因组关联分析(GWAS)分析同样鉴定出多个重要经济性状相关基因，如胰岛素样生长因子2信使核糖核酸结合蛋白1(IGF2BP1)可使北京鸭体格增大15%，并提高6%的饲料转化率[5]；苏氨酸天冬氨酸酶1(TASP1)有助于增加肌纤维直径[9]；三磷酸腺苷结合盒转运蛋白G2(ABCG2)启动子区域的1个SNP变异影响鸭蛋壳颜色[10]。选择信号分析与重要经济性状候选基因的鉴定大大推动了品种改良进程，为畜牧业带来了巨大效益。因此，利用选择信号法对不同白羽肉鸭品种进行分析，可以鉴定品种间遗传分化的基因组区域，追溯品种在不同人工选择下的基因组变异机制，以此阐明优异性状形成的遗传基础。

本研究旨在对2个白羽肉鸭品种的选择信号进行筛选，基于全基因组SNP变异，使用Fst和θπ2种分析方法发掘品种间遗传分化信号，以期为瘦肉型白羽肉鸭品种的持续选育提供有效参考。

1 材料与方法

1.1 材料

于山东新希望六和集团有限公司养殖基地和内蒙古塞飞亚集团有限公司养殖基地分别随机挑选饲养至6周龄的樱桃谷鸭商品代和中畜草原白羽肉鸭商品代各16只。翅静脉采血2～5 mL，并使用肝素钠抗凝，-20 ℃保存用于后续全基因组DNA提取与重测序。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取与重测序 使用酚-仿法提取32个样本的全基因组DNA。基于Illumina测序平台进行建库和双端测序。其中，樱桃谷鸭(n=16)测序深度为5×，数据量5G/样。中畜草原白羽肉鸭(n=16)测序深度为10×，数据量10G/样。

1.2.2 SNP检出 对raw reads去除接头和低质量reads后，得到clean reads。使用BWA[11]软件将其与北京鸭参考基因组GCF_003850225.1(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly/GCF_003850225.1)进行比对，使用GenomeAnalysisTK(GATK，v3.5)[12]确定需要重新比对的区域并进行再比对，以增强后续SNP检出的准确性。使用GenomeAnalysisTK软件进行SNP变异信息的检测与分型，个体基因组变异信息被合并后保存至VCF格式的文件中以供后续分析。使用VCFtools(v0.1.16)[13]对群体基因组变异信息进行质控并用于后续分析。质控标准如下：①保留3×<平均测序深度<30×的SNP位点；②保留0.05<最小等位基因频率<0.99的SNP位点；③保留检出率>90%的SNP位点；④保留二等位的SNP位点。

1.2.3 主成分分析 使用PLINK(v1.90)[14]软件对质控后的SNP进行主成分分析[15]，并用R语言plot函数对分析结果可视化。

1.2.4 选择信号分析 本试验采用Fst来检测樱桃谷鸭与中畜草原白羽肉鸭群体间分化程度。为降低选择信号的假阳性，选择以滑动窗口的方式计算Fst以提高信号的灵敏性。利用VCFTools，以10 kb窗口、5 kb步长滑动计算2个群体间的Fst值。同时基于基因组杂合度计算两个群体的θπ。每个群体的θπ值同样以10 kb为窗口、5 kb为步长在基因组上滑动计算。对2个群体分别计算出的θπ值进行标准化处理，每个θπ值取指数对数。然后以樱桃谷鸭作为参考群，中畜草原白羽肉鸭作为试验群计算2个群体间标准化后的群体核酸多样性比值(Pi)用于图形展示。计算公式为：

Pi=ln(θπ)樱桃谷鸭-ln(θπ)中畜草原白羽肉鸭

区域内的Pi值越大说明2个群体在该基因组区域的分化越明显。将Fst计算值与Pi值的前1%重叠区域作为候选区域。

1.2.5 候选区域基因注释及富集分析 使用NCBI数据库下载的基因组注释文件对候选区域进行基因注释。使用DAVID[16]与KOBAS[17]生物信息网站进一步对候选基因进行GO功能和KEGG通路富集分析，筛选候选基因。

2 结 果

2.1 樱桃谷鸭与中畜草原白羽肉鸭的主成分分析

基于2个群体的全基因组SNP变异对2个白羽肉鸭品种进行主成分分析。选取前2个主成分进行绘图，结果如图1。2个白羽肉鸭品种在PC2上明显分离，说明2个白羽肉鸭品种虽然均源自北京鸭保种群，但经过持续、定向化选育已经分化成2个在基因组层面有显著差异的群体。

2.2 樱桃谷鸭与中畜草原白羽肉鸭的选择信号检测

以樱桃谷鸭作为参考群，中畜草原白羽肉鸭作为试验群，根据10 kb滑动窗口、5 kb步长计算2个白羽肉鸭群体的Fst，所得Fst平均值为0.038，Fst前1%阈值为0.177(图2A)。高于阈值线的窗口共有1 372个，占据6.86 Mb的基因组区域。其中3号染色体100 265 001—100 270 000 bp区间内Fst值最高，平均值为0.543。 在第5号染色体上受到选择的显著性区域最多，有344个窗口区间超过阈值线。

以相同窗口、步长计算樱桃谷鸭与中畜草原白羽肉鸭和核酸多样性。中畜草原白羽肉鸭θπ平均值(0.00222)高于樱桃谷鸭(0.00155)，说明前者保留了更多的遗传多样性。所得群体间Pi的平均值为0.0377，Pi的前1%阈值为0.885(图2B)。有1 487个窗口区间超过阈值线，共占据7.435 Mb大小的基因组区域。Pi值最高点位于5号染色体上，其中5号染色体52 520 001-52 525 000 bp区间内选择信号最强，平均值为4.97。 此外，在第1、2、9、11、13和16号染色体上也有较强的选择信号。筛选Fst计算值与Pi比值前1%的重叠区域(图2)，共获得410 kb大小的候选区域。

图1 2个白羽肉鸭品种的主成分分析Fig.1 Principal component analysis of two White-feather duck breeds

A，Fst选择信号分析；B，Pi比值选择信号分析A，Selection signature analysis by Fst；B，Selection signature analysis by Pi图2 2个白羽肉鸭品种常染色体上的选择信号分布分析Fig.2 Distribution of selection signals identified on autosomes of two White-feather duck breeds

2.3 候选区域基因注释与富集分析

使用参考基因组GCF_003850225.1对应的gff注释文件对候选区域进行基因注释，区域内共注释到21个基因。 对21个候选基因进行GO功能富集分析，结果显示共12条GO条目显著富集(P<0.05)(图3)，包含12个候选基因：PDE3A、PRKAR2B、GJD2、SEMA5A、LOC101803508(GOLGB1)、TMEM114、PTPRO、STXBP6、HS6ST1、SLC25A22、CNTNAP5和SHANK2。对21个候选基因进行KEGG通路富集分析，结果表明，候选基因共富集到10条KEGG通路，基因功能涉及黏多糖生物合成、丙酸代谢、乙醛酸和二羧酸代谢、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的降解、细胞间隙连接、碳代谢、胰岛素信号通路、嘌呤代谢、细胞周期等方面，其中有4条通路显著富集(P<0.05)，涉及到2个候选基因：HS6ST1与PCCB(表1)。

基于Fst>0.250对GO与KEGG富集到的13个候选基因进一步筛选，发现6个强烈受选择的基因：PDE3A、PRKAR2B、SEMA5A、SHANK2、STXBP6和LOC101803508(GOLGB1)(Fst>0.250，Pi>0.936)(表2)，主要富集在脂质代谢、氨基酸代谢、繁殖能力等通路。

图3 21个候选基因的GO功能富集分析Fig.3 GO function enrichment analysis of 21 candidate genes

表1 21个候选基因的KEGG通路富集分析

表2 强选择信号下的基因及其功能

3 讨 论

为了满足国内对肉鸭多元化的消费需求，提升中国肉鸭行业的国际竞争力,本团队利用中国北京鸭品种资源培育了中畜草原白羽肉鸭新品种。该品种不仅更符合国内市场需求，且其关键生产性能指标如料重比、胸肉率、皮脂率等较引进品种而言更具优势[18]。本研究中，基于重测序数据对樱桃谷鸭与中畜草原白羽肉鸭基因组进行遗传分化分析，PCA结果证明2个品种已经发生了明显分化，Fst与Pi平均值同样证明2个群体有中等程度的遗传分化,且中畜草原白羽肉鸭相较于樱桃谷鸭具有更高的遗传多态性。品种遗传多态性越高，群体的遗传变异程度就越高，群体适应潜在的环境变化的能力越强[19]，同时为满足多元化市场需求提供了变异基础。

结合Fst与Pi综合分析2个品种间选择信号并对候选区域进行基因注释，共注释到了21个基因,这些基因参与调节代谢、繁殖、免疫、神经发育等。其中，KEGG显著富集到4条通路，涉及2个候选基因HS6ST1与PCCB。研究表明，HS6ST1基因参与硫酸乙酰肝素的代谢，同时也参与牛肌肉脂质代谢的调控[20]。PCCB基因是生物素依赖性丙酰辅酶A羧化酶(PCC)的2个亚基之一[21]，参与脂肪酸生物合成和短链脂肪酸分解代谢过程，为影响肉鸡肌内脂肪沉积的差异表达基因[22]。肉的多汁性、风味和嫩度等品质特征主要取决于肌肉总脂肪含量，推测中畜草原白羽肉鸭与樱桃谷鸭在肌内脂肪沉积能力上发生了分化，因而HS6ST1与PCCB基因受到了选择。遗传分化指数的提出者Wright认为，当Fst>0.250时，群体间有很大的遗传分化[23]。因此，基于Fst>0.250对GO与KEGG富集到的共计13个候选基因进一步筛选发现，有6个基因PDE3A、PRKAR2B、SEMA5A、SHANK2、STXBP6与LOC101803508(GOLGB1)受到了较强的选择(Fst>0.250，Pi>0.936)。其中，PDE3A是在心肌细胞和血小板环磷酸腺苷(cAMP)介导的细胞内信号调节中起重要作用的酶[24]。结合前期北京鸭不同组织器官时空转录组基因表达数据[5]，发现PDE3A在8周龄北京鸭的心脏与腹脂中高表达。已有研究表明，PDE3A参与代谢，可以促进小鼠胃肠道蠕动[25],还作用于动物的卵泡，影响卵泡成熟[26]，从而影响动物繁殖性能。PRKAR2B被证实为精子发生的热敏基因[27]，且被鉴定为蛋重的候选基因[28]。此外，PRKAR2B基因影响脂质储存和代谢[29]，是小鼠和人类脂肪细胞分化所必需的[30],该基因在8周龄北京鸭腹脂中高表达[5]，推测PRKAR2B基因与中畜草原白羽肉鸭的繁殖与优良肉质性状有关而受到选择。研究证实，SEMA5A基因参与肉鸡的免疫调控[31]，并在北京鸭腹脂中高表达[5]。SHANK2基因调节昼夜节律通路。大鼠节律基因的差异表达与脂质代谢基因的差异表达呈正相关，昼夜节律影响甘油酯类和甘油磷脂类脂质物质的代谢[32]。甘油酯与甘油磷脂是肉制品风味物质或风味前体物质的重要来源[33]。北京鸭全谱转录组数据显示，SHANK2基因在北京鸭脑中有较高的表达水平，且该基因在中畜草原白羽肉鸭群体中受到强选择，说明经过长期人工选育，中畜草原鸭可能在昼夜节律上同樱桃谷鸭发生了较大分化，影响了甘油酯类和甘油磷脂类物质的代谢，使其具有优质风味。SHANK2基因影响肉鸡神经发育、细胞增殖和分化以及采食量[34]。 STXBP6是从脑中分离出来的突触结合蛋白，在北京鸭脑、脾脏中高表达[5]。小鼠STXBP6表达量上调会间接抑制胰岛素分泌而增加糖尿病的风险[35]，敲除STXBP6可能会引起小鼠代谢异常从而降低小鼠体重[36]。LOC101803508基因在人类中又名GOLGB1基因，参与蛋白质代谢与囊泡运输，在北京鸭腹脂中高表达[5]。

脂肪酸与氨基酸的种类及含量是影响肉类风味品质的重要因素[37]，相对于樱桃谷鸭，PDE3A、PRKAR2B、SEMA5A、SHANK2、STXBP6和LOC101803508(GOLGB1)基因在中畜草原白羽肉鸭基因组上受到较强的选择，这可能影响中畜草原白羽肉鸭繁殖力与风味肉品质。但中畜草原白羽肉鸭与樱桃谷鸭遗传分化候选基因的功能及其精细定位仍需进一步研究。随着人民生活水平的提高，对肉类的要求逐渐从产量向品质转变，尤其是对禽肉的要求更为突出。定位影响肉品质的主效基因，探索生长速度、产量与肉品质之间的平衡关系并将其用于家禽生产将是未来家禽育种的新方向。本研究筛选到的脂质代谢、氨基酸代谢、免疫调控相关的基因，如PDE3A、PRKAR2B、SEMA5A、SHANK2、STXBP6与LOC101803508(GOLGB1),为后续筛选白羽肉鸭品种特异性分子标记提供了参考。

4 结 论

本研究利用二代重测序数据，联合Fst与Pi分析方法对2个源于北京鸭资源群体的瘦肉型白羽肉鸭品种进行遗传差异分析，发现中畜草原白羽肉鸭保留了更多的遗传多样性。鉴定到白羽肉鸭在选育过程中的候选基因21个，其中与繁殖力和风味肉品质相关的6个基因PDE3A、PRKAR2B、SEMA5A、SHANK2、STXBP6与LOC101803508(GOLGB1)受到了强选择。