蛋鸭circ-ZNF326的特征分析、过表达载体的构建及对小肠上皮细胞增殖的影响

魏文焯，郑 超，吴 艳，梁振华，皮劲松，杜金平，李成凤，张 昊

(1.湖北省农业科学院畜牧兽医研究所，动物胚胎工程及分子育种湖北省重点实验室，武汉 430064；2.西南科技大学生命科学与工程学院，绵阳 621010；3.湖北神丹健康食品有限公司，安陆 432600)

环状RNA(circRNA)是一类广泛存在于生物体细胞中的非编码RNA分子(ncRNA)，是不具有5′-末端帽子和3′-末端poly(A)尾巴、并以共价键形成环形结构的内源性非编码RNA分子[1-2]。它是通过前体mRNA(pre-mRNA)反向剪接，即下游5′-端剪接位点与上游3′-端剪接位点反向连接，在连接位点形成一个具有3′,5′-磷酸二酯键，最终以共价闭合形态广泛存在于各种真核生物体中[3-4]。随着高通量RNA测序技术、生物信息学技术和基因功能研究的不断发展，人们逐渐发现circRNA在机体内发挥着重要作用。2012年，Salzman等[5]利用转录组测序技术发现，circRNA在人类细胞中广泛存在，引发学术界对circRNA的研究热度不断提升，目前已经成为分子生物学领域的研究热点。

众所周知，上皮细胞的增殖分化是机体自我修复的一种方式，当机体受到损伤时，上皮细胞就开始进行增殖分化，修复受损组织。而circRNA在上皮细胞的增殖分化中扮演重要角色，有研究表明，circRNA 3890可协同miR-26b-3p调控奶山羊子宫内膜上皮细胞的增殖分化[6]。ZNF326是一种调节细胞生长、促进细胞增殖与迁移的基因[7-9]，近年来研究较为广泛。ZNF326经过反向剪接可形成circ-ZNF326，而circ-ZNF326生物学功能及作用机制却鲜见报道。因此，本试验利用反向剪接位点验证circ-ZNF326成环方式，检测其在细胞中的核质分布情况，并构建PLCDH-ciR真核表达载体，利用实时荧光定量PCR技术检测circ-ZNF326的表达效率，利用转染、CCK-8等方法检测过表达circ-ZNF326对蛋鸭小肠上皮细胞增殖的影响，为深入研究circ-ZNF326的生物学功能及其对蛋鸭小肠上皮细胞增殖的调控机制奠定了理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

在湖北省农业科学院蛋鸭场选择绿头鸭种蛋10枚，将种蛋放入孵化箱，孵至26胚龄用于分离培养蛋鸭肠上皮细胞。

1.2 主要试剂与仪器

大肠杆菌DH5α感受态细胞由湖北省农业科学院畜牧兽医研究所保存；聚合酶I-5TM2×High-Fidelity Master Mix购自北京擎科生物科技有限公司；环状RNA表达载体PLCDH-ciR、Lipofectmin 3000均购自吉赛生物科技(广州)有限公司；限制性内切酶EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ、T4 DNA连接酶及高保真DNA聚合酶均购自上海起发实验试剂有限公司；凝胶回收试剂盒与质粒提取试剂盒均购自上海北诺生物科技有限公司；反转录试剂盒与核质分离试剂盒(PARISTM Kit)购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司。

超净工作台(HD-1360)购自哈尔滨市东联电子有限公司；凝胶成像仪和PCR扩增仪均购自伯乐生命医学产品(上海)有限公司；离心机购自艾本德(上海)国际贸易有限公司；数显恒温水浴锅(HH-6)购自国华电器有限公司；全自动高压蒸汽灭菌器购自致微(厦门)仪器有限公司；CO2恒温培养箱购自宾德股份公司。

1.3 方法

1.3.1 RNA提取及反转录 准备3枚26胚龄鸭胚，在超净台中取鸭胚十二指肠组织，然后利用Trizol法提取肠道组织RNA。利用反转录试剂盒将提取的肠道组织RNA反转录为cDNA，储存于-20 ℃备用。

1.3.2 鸭小肠上皮细胞的分离培养 另取3枚26胚龄的啄壳鸭胚，在超净台中使用无菌操作取出鸭胚的小肠组织，放入提前准备好的DPBS溶液中，利用DPBS溶液清洗小肠组织，去除胰腺和肠系膜后把小肠剖开，用DPBS溶液清洗小肠内壁，直至上液清亮，将清洗好的小肠剪成1～2 mm的组织块，放入DPBS溶液中。利用1%的Ⅰ型胶原酶消化液20 mL消化小肠组织块，37 ℃、80 r/min振荡消化60 min，后用DPBS清洗3次。利用PBS溶液轻柔吹打小肠组织块，收集上层细胞悬浮液，并保留组织块继续加入PBS吹打，重复上述步骤6～7次，直至上液清亮。 将获得的细胞悬液1 000 r/min离心3 min后弃上清，将获得的细胞团用完全培养基吹打重悬，并用100 μm细胞筛过滤，鸭小肠上皮细胞完全培养基为：DMEM-F12培养基中加入5%胎牛血清，0.5%肝素钠(100 μg/mL)，0.1%表皮生长因子(105 ng/mL)，0.1%胰岛素(25 mg/mL)，1%青链霉素(10 000 U)。过筛后的细胞用完全培养基悬浮吹打均匀，并将其接种到细胞培养瓶中，37 ℃、5% CO2培养箱内培养90 min，去掉贴壁杂细胞，收集未贴壁细胞，细胞按照1×107/mL密度接种于细胞培养板，37 ℃、5% CO2培养箱内培养。

1.3.3 circ-ZNF326的成环验证及测序验证 根据前期全转录组测序数据(未发表)分析得到circ-ZNF326的全长序列，并采用Primer Premier 5.0软件设计circ-ZNF326成环验证引物：F：5′-ACCCAATAGTCAAGGCACG-3′；R：5′-TGCTG-CTGAACGGAACTG-3′。以蛋鸭肠道组织cDNA为模板，进行PCR扩增，预期PCR产物长度为234 bp。PCR反应体系为50 μL：模板cDNA 5 μL，2×FastTaqPremix 25 μL，上、下游引物各1.5 μL，ddH2O 17 μL。PCR扩增程序：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35个循环；72 ℃延伸5 min。PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，将胶块内的目的条带切下送奥科鼎盛(武汉)生物科技有限公司进行测序。

1.3.4 实时荧光定量PCR检测circ-ZNF326在细胞核与细胞质中的分布 利用核质分离试剂盒PARISTM Kit分别提取肠上皮细胞中细胞核与细胞质的RNA，分别取等量的细胞核与细胞质的RNA，利用反转录试剂盒反转录合成cDNA，具体操作按照试剂盒说明书进行，反应体系10 μL：5×gDNA Eraser Buffer 2 μL，gDNA Eraser 1 μL，Total RNA 1 μL，ddH2O 6 μL。参照circ-ZNF326全长序列设计实时荧光定量PCR引物，circ-ZNF326引物：F：5′-ACCCAATAGTCAAGGCA-CG-3′，R：5′-TGCTGCTGAACGGAACTG-3′(预期扩增234 bp)；内参基因β-actin引物：F：5′-GC-TATGTCGCCCTGGATTT-3′；R：5′-GGATGCC-ACAGGACTCCATAC-3′(预期扩增367 bp)。分别以细胞核与细胞质的cDNA为模板，进行实时荧光定量PCR检测。PCR反应体系15 μL：cDNA模板1 μL，THUNDERBID SYBR®qPCR Mix 7.5 μL，上、下游引物各0.4 μL，ddH2O 5.7 μL。PCR反应程序：98 ℃预变性10 s；94 ℃变性15 s，58 ℃退火30 s，60 ℃延伸15 s，共45个循环；65 ℃延伸60 s。将细胞核中circ-ZNF326的相对表达量设为基准(值为1)，采用2-△△Ct方法处理数据，分析circ-ZNF326在细胞核与细胞质中的表达情况。

1.3.5 过表达载体的构建与验证

1.3.5.1 circ-ZNF326序列全长的合成 分析前期全转录组测序结果得到circ-ZNF326的全长序列(未发表)，根据序列设计合成含EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ酶切位点的circ-ZNF326全长序列，片段由奥科鼎盛(武汉)生物科技有限公司合成，合成片段如图1所示。

加粗下划线标记碱基代表酶切位点，虚线下划线标注碱基代表circ-ZNF326全长序列Bases are underlined in hold to represent the restriction sites,and bases are underlined in dashed to represent the full length circ-ZNF326 sequence图1 circ-ZNF326全长序列合成片段Fig.1 Synthetic fragment of circ-ZNF326 full-length sequence

1.3.5.2 circ-ZNF326过表达载体的构建与验证 将含有circ-ZNF326全长序列的质粒与PLCDH-ciR真核表达载体(图2)经EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切并切胶回收。在二者回收产物中加入T4连接酶和Buffer，16 ℃连接2 h。反应体系：胶回收产物各4 μL、10×Buffer 1 μL、T4连接酶1 μL。连接体系加入50 mL大肠杆菌DH5α感受态细胞，均匀涂布于含氨苄(Amp)的LB固体培养基上，于37 ℃培养箱中过夜。提取重组载体质粒，将重组质粒利用EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切，酶切产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。利用含有Amp的LB培养基筛选阳性克隆，将阳性菌液送奥科鼎盛(武汉)生物科技公司测序，利用DNAStar软件将测序所得碱基序列与目的序列进行比对分析。

图2 PLCDH-ciR模式图Fig.2 Schematic diagram of PLCDH-ciR expression vector

1.3.5.3 实时荧光定量PCR验证circ-ZNF326的过表达效率 将分离培养的鸭小肠上皮细胞均匀接种于6孔板中，第一排3个孔加入7 μL的Lipofectmin 3000和2.5 μg circ-ZNF326过表达重组质粒(过载组，circ-ZNF326)，第二排3个孔中加入7 μL的Lipofectmin 3000和2.5 μg PLCDH-ciR载体质粒(空载组，PLCDH)于细胞培养箱中培养，24 h后提取RNA，将提取的RNA反转录为cDNA，具体操作按照试剂盒说明书进行，荧光定量PCR反应体系与程序同1.2.4。

1.3.6 CCK-8检测过表达circ-ZNF326对蛋鸭小肠上皮细胞增殖的影响 利用鸭胚分离培养小肠上皮细胞，将细胞分别接种在3个96孔板中，每块96孔板设置空载组(PLCDH)和过载组(circ-ZNF326)，每组设置5个重复孔，标记为24、48、72 h。过载组每孔加入0.3 μL的Lipofectmin 3000和0.1 μg的circ-ZNF326表达载体质粒，空载组每孔加入0.3 μL的Lipofectmin 3000和0.1 μg的PLCDH-ciR载体质粒，放入细胞培养箱中培养。分别在上述3个时间点向每孔中加入20 μL CCK-8溶液，放入细胞培养箱中孵育1 h。孵育结束后，利用酶标仪测定450 nm处吸光度。

1.4 数据统计分析

采用SPSS 23.0软件进行方差分析。P<0.05表示差异显著;P<0.01表示差异极显著。所有数据采用GraphPad Prism 7.0软件制图，结果以平均值±标准误表示。

2 结 果

2.1 circ-ZNF326反向剪接的验证

如图3测序结果所示，其中右边框中的碱基序列为ZNF326基因第10号外显子起始序列，左边框中的碱基序列则为第12号外显子末尾序列。此外，琼脂糖凝胶电泳结果显示，PCR扩增产物的长度接近250 bp(图4)，与预期相符。

图3 circ-ZNF326反向剪切位点测序图(A)及形成示意图(B)Fig.3 Sequencing (A) and formation diagram (B) of circ-ZNF326 reverse shear site

图4 circ-ZNF326的PCR扩增结果Fig.4 PCR amplification results of circ-ZNF326

2.2 circ-ZNF326的核质分布情况

由图5可知，circ-ZNF326在细胞质中的相对表达量极显著高于细胞核(P<0.01)，表明circ-ZNF326可能主要在细胞质中发挥作用。

2.3 circ-ZNF326过表达载体的构建及鉴定

将重组质粒利用EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切，结果如图6所示， 出现2条清晰明亮的条带，与预期结果相符。 此外，阳性菌液测序结果与目的序列一致。

**，差异极显著(P<0.01)。图7同**,Extremely significant difference (P<0.01).The same as fig.7图5 细胞质与细胞核中circ-ZNF326的相对表达量Fig.5 Relative expression of circ-ZNF326 in cytoplasm and nucleus

图6 circ-ZNF326过表达质粒的双酶切鉴定Fig.6 Identification of circ-ZNF326 recombinant plasmid by double digestion

2.4 circ-ZNF326过表达效率检测

如图7所示，过载组蛋鸭小肠上皮细胞中circ-ZNF326的相对表达量极显著高于空载组(P<0.01)，证明circ-ZNF326过表达载体构建成功，可用于后续试验。

2.5 过表达circ-ZNF326对蛋鸭小肠上皮细胞增殖的影响

由图8可知，转染了circ-ZNF326过表达载体的试验组蛋鸭小肠上皮细胞活力极显著或显著高于空载组(P<0.01；P<0.05)，表明过表达circ-ZNF326会使蛋鸭小肠上皮细胞加速增殖。

图7 circ-ZNF326过表达载体的表达效率Fig.7 Expression efficiency of circ-ZNF326 overexpressing vector

与空载组相比，*，差异显著(P<0.05)；**，差异极显著(P<0.01)Compared with vector group，*,Significant difference (P<0.05)；**,Extremely significant difference (P<0.01)图8 过表达circ-ZNF326对蛋鸭小肠上皮细胞增殖的影响Fig.8 Effects of overexpression of circ-ZNF326 on proliferation of small intestinal epithelial cells in laying ducks

3 讨 论

肠道是机体消化吸收营养物质的主要器官，也是防止肠道微生物侵袭的先天屏障，肠道屏障功能的完整性对机体的正常生长发育起着至关重要的作用[10]，而应激产生的大量ROS会破坏机体氧化系统与抗氧化系统之间的平衡[11]，对肠道屏障功能造成损伤，引发肠屏障功能障碍[12-14]。肠上皮细胞、免疫系统和肠道菌群可维持正常肠道稳态和屏障完整性[15]。为应对微生物的侵袭，肠上皮细胞发生凋亡，以维持肠上皮的正常功能，保持组织的持续更新和稳态，但肠上皮细胞凋亡会导致肠道通透性和屏障功能障碍增加，引发多种急慢性肠道疾病[16]。因此，促进肠上皮细胞的增殖分化，对维持肠道屏障功能的完整性有重要作用。

越来越多的研究表明，包括miRNAs、circRNAs和lncRNA等非编码RNA在各种生物学过程中发挥重要的调控功能[17-19]。作者前期研究中利用测序技术鉴定了不同养殖模式的蛋鸭肠道中差异表达的circRNA，并对特定circRNA的功能进行了研究，其中circ-ZNF326是ZNF326基因经过反向剪接所形成的circRNA，ZNF326可调控细胞的增殖(未发表)。有研究表明，miR-21可靶向抑制ZNF326基因的表达,进而促进乳腺癌细胞增殖、迁移[20]。由此推测，由ZNF326所编码的circ-ZNF326也具备调控细胞增殖迁移的能力。本试验通过circRNA反向剪接位点验证circ-ZNF326的成环方式、并分别提取细胞核与细胞质RNA检测其在细胞中的核质分布情况，分析其基本特征。结果发现ZNF326基因中第10、11和12号外显子可经反向剪接，使第12号外显子的3′-端连接到10号外显子5′-端，进而形成环状结构。此外，实时荧光定量PCR结果显示，circ-ZNF326主要在细胞质中发挥作用。目前研究表明circRNA主要在细胞质中发挥内源性竞争RNA(competing endogenous RNAs,ceRNA)作用，但有研究发现，某些circRNA能在细胞核中发挥可调控来源基因转录的功能[21-22]，提示circ-ZNF326在细胞质内可能作为ceRNA发挥吸附miRNA作用，具体功能还需要进一步验证。目前，circRNA对蛋鸭肠道的影响鲜见报道,仅有少量研究表明，circRNA在蛋鸭脂肪细胞分化中起作用[23]。因此，本研究利用circRNA表达载体，对circ-ZNF326表达载体质粒在蛋鸭肠上皮细胞中进行过表达研究，结果发现过表达circ-ZNF326可提高肠上皮细胞的活力，从而提高蛋鸭的肠道屏障功能，减少蛋鸭肠道疾病的发生。此外，circ-ZNF326对蛋鸭小肠上皮细胞活力的作用机制还有待研究。

4 结 论

本试验成功验证了circ-ZNF326的反向剪接与环状结构，证明了circ-ZNF326主要富集在细胞质中，并构建了circ-ZNF326过表达载体，证实了过表达circ-ZNF326可提高蛋鸭小肠上皮细胞的活力，为深入研究circ-ZNF326的生物学功能及其对蛋鸭小肠上皮细胞增殖的调控机制奠定了理论基础。