缺血时间差异对大鼠肠缺血再灌注损伤的影响研究

潘晓慧,张朋辉,江国健,李 娟,陈桂煌,姚欣伶,冯学轩

(广东省医学实验动物中心,广州 528248)

小肠缺血再灌注损伤(intestinal ischemiareperfusion injury,IIRI)主要是指由于肠道疾病或肠道外科手术等原因引起肠道缺血,在恢复血流供应时,产生大量的氧自由基,由于组织细胞内线粒体功能未恢复,对氧自由基清除能力不足,引起氧化应激压力上升,导致细胞损伤,进而加速细胞凋亡[1-3]在临床上表现为肠道功能紊乱和结构损伤、全身炎性反应综合征、多器官功能衰竭等,最终可导致死亡,肠黏膜损伤且伴有肠系膜缺血的患者死亡率可高达59%～93%[4-5],其死亡率之高及预后不良使得IIRI 成为了临床上研究的热点。如何成功建立与临床症状相一致的IIRI 模型,将有助于推动该类疾病的基础研究,包括临床症状研究及预后研究,也将有利于药物干预研究。但目前针对IIRI 建模的研究较为薄弱,缺血时间对于IIRI 模型的成立起着至关重要的作用,缺血时间的长短决定了机体内自由基的多少及氧化应激压力的高低,缺血时间过短未必能造成损伤,缺血时间过长会使组织直接在缺血期发生不可逆损伤甚至坏死,目前针对IIRI建模的研究较为薄弱,而缺血时间对于IRII 模型的成立起着至关重要的作用。因此,本实验主要研究关键因素——缺血时间,对IIRI 模型建立的影响,并从发病机制、氧化损伤层面及组织病理学方面评价模型的适用性,为用于缺血再灌注损伤防治药物的研发提供相应的模型工具及基础数据。

1 材料和方法

1.1 实验动物

24 只SPF 级SD 大鼠,雄性,体重221.2～230.6 g,购于广东省医学实验动物中心[SCXK(粤)2018-0002]。动物饲养在广东省医学实验动物中心SPF级动物房[SYXK(粤)2018-0002],饲养温度与湿度:20℃～26℃,40%～70%,采用10 h:14 h 昼夜间断照明。动物自由进食和饮水,所有饲料和饮用水均由广东省医学实验动物中心提供。本实验经广东省医学实验动物中心动物伦理委员会批准(B202005-6),并按实验动物使用的3R 原则给予人道的关怀。

1.2 主要试剂与仪器

戊巴比妥钠:批号P3761,德国默克生产;乌来糖:批号20171219,国药集团化学试剂有限公司生产;氯化钠注射液,批号:201207136,安徽丰原药业股份有限公司淮海药厂生产;SOD 试剂盒,批号:20210604,南京建成生物工程研究所生产;GSH-Px试剂盒,批号:20210603,南京建成生物工程研究所生产;MDA 试剂盒,批号:20210605,南京建成生物工程研究所生产;GSH 试剂盒,批号:20210605,南京建成生物工程研究所生产。

BS-3000A 电子分析天平,感量:0.1 g,上海友声衡器有限公司生产;BSA224S 电子分析天平,感量:0.1 mg,赛多利斯科学仪器(北京)科技有限公司生产;KDC-2046 低速冷冻离心机:科大创新股份有限公司中佳分公司生产;RM2135 轮转切片机:德国LEICA 公司生产;ASP300S 生物组织全自动脱水机:德国LEICA 公司生产;EG1150 生物组织包埋机及冷冻机:德国LEICA 公司生产;CS-VI 摊片烤片机:湖北孝感医用仪器有限公司生产;AutoStainer-XL 生物组织全自动染色机:德国LEICA 公司生产;BX43 型生物显微镜:日本OLYMPUS 生产;CellSens Standard 显微图像软件:日本奥林巴斯公司提供。

1.3 实验方法

1.3.1 实验动物分组

将24 只SD 大鼠检疫结束后,根据体重随机分为假手术组、缺血30 min 组、缺血1 h 组、缺血2 h组,6 只/组。

1.3.2 模型制备

按2 mL/kg 体重的剂量腹腔注射3%的戊巴比妥钠溶液将SD 大鼠麻醉,先腹部剃毛备皮,之后仰卧位固定,于腹部正中,腹白线处开腹,分离肠系膜上动脉,用4 号手术线活结结扎根部使缺血,直至见肠系膜血管颜色变浅,即为缺血成功。动物按20 mL/kg 体重腹腔注射氯化钠注射液进行补液在缺血开始及再灌注开始时,假手术组只分离肠系膜上动脉,不进行缺血再灌注。各实验组缺血对应时间后,将活结解开,恢复供血4 h 后大鼠按60 mL/kg体重腹腔注射20%乌来糖溶液麻醉,腹主动脉采血后处死,取小肠进行氧化指标及组织病理学检测。

1.3.3 指标检测

(1)肠道组织大体剖检观察

大鼠大体剖检肉眼观察肠道变化。

(2)氧化指标检测

取10%肠组织匀浆,按各试剂盒说明,测定SOD、GSH-Px 活性及MDA、GSH 含量。

(3)肠组织病理学观察及肠组织损伤评分

动物安乐死后取小肠固定于4%中性甲醛固定液,进行常规石蜡切片,HE 染色观察,并测量小肠绒毛高度及粘膜厚度,观察炎症细胞聚集情况并进行炎症细胞浸润情况评分,见表1。参照Chiu’s 6 级评分法对小肠组织进行半定量评分,见表2。

表1 炎症细胞浸润情况评分标准Table 1 Inflammatory cell infiltration scoring standard

表2 小肠组织损伤Chiu’s 评分量表Table 2 Intestinal tissue injury Chiu’s score

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 动物死亡情况

缺血2 h 组其中两只大鼠缺血2 h 恢复供血后出现严重拉稀,并于缺血3 h 后死亡,剖检发现小肠出血,瘀黑,死亡动物实验结果未参与统计。

2.2 大体剖检结果比较

假手术组小肠表面红润有光泽,回肠至盲肠处内容物成型;缺血30 min 组小肠轻微胀气,内容物偏软;缺血1 h 组肛门处可见稀便,小肠肠壁变薄,小肠内胀气明显,内容物呈黄色啫喱状,偶见出血点;缺血2 h 组,拉稀严重,小肠内可见明显出血,小肠肠壁变薄且全部肠段胀气明显,内容物呈红色啫喱状。

2.3 SOD、GSH-Px 活性及MDA、GSH 含量比较

与假手术组比较,缺血30 min 组和缺血1 h 组MDA 含量升高(P<0.05)(图1A),缺血1 h 组SOD活性显著升高(P<0.05)(图1B),各缺血组GSH-Px活性升高(P<0.01)(图1C),缺血30 min 组和缺血2 h 组GSH 含量降低(P<0.05)(图1D)。

图1 不同组别MDA、GSH 含量及SOD、GSH-Px 活性比较Figure 1 Comparison of MDA and GSH contents and SOD and GSH-Px activities in different groups

2.4 肠组织病理学结果比较

2.4.1 组织病变

假手术组小肠黏膜层、肌层完整,黏膜上皮细胞排列整齐、未见变性、坏死、炎症,部分黏膜下层见淋巴小结,血管未见扩张、出血;缺血30 min 组小肠绒毛顶端上皮下间隙增宽、毛细血管淤血,黏膜层极少量炎细胞浸润;缺血1 h 组小肠绒毛顶端上皮下间隙增宽或绒毛顶端部分破损、毛细血管淤血,个别样本黏膜上皮细胞坏死、溃疡、固有层破坏、固有层及黏膜下层血管淤血、出血,黏膜层极少量至轻度炎细胞浸润;缺血2 h 组小肠黏膜上皮细胞坏死、溃疡、固有层破坏、固有层及黏膜下层血管淤血、出血,黏膜层轻度炎细胞浸润,见图2。

图2 不同组别小肠组织病理学变化情况(HE 染色)Figure 2 Histopathological changes of intestine in different groups(HE staning)

2.4.2 绒毛高度

与假手术组比较,缺血1 h 组、缺血2 h 组小肠绒毛高度降低,有统计学差异(P<0.01),见表3。

2.4.3 黏膜厚度

与假手术组比较,缺血1 h 组、缺血2 h 组小肠黏膜厚度减小,有统计学意义(P<0.01),见表3。

2.4.4 炎症细胞浸润情况评分

与假手术组比较,各缺血组小肠均有不同程度的炎症细胞浸润,且有统计学意义(P<0.05),见表3。

2.4.5 Chiu’s 评分

与假手术组比较,各缺血组小肠均有不同程度的病理学改变,且有统计学意义(P<0.05),见表3。

表3 肠组织病理学结果()Table 3 Intestinal histopathology results

表3 肠组织病理学结果()Table 3 Intestinal histopathology results

注:与假手术组相比,∗P<0.05,∗∗P<0.01。Note.Compared with the sham operation group,∗P<0.05,∗∗P<0.01.

3 讨论

据报道,氧化应激、炎症反应及继发性细胞凋亡是小肠缺血再灌注损伤发生发展的重要病理机制[6-8]。小肠动脉缺血情况下,氧供给下降,导致氧自由基大量产生并激活炎症因子,引起炎细胞在病灶上聚集[9-11],因此,不同缺血时间下机体的氧化应激水平以及小肠黏膜结构的改变及炎细胞浸润程度能很好反映IIRI 的情况。以此为切入点,本研究从氧化水平和病理层面探讨了IIRI 模型的建模条件。

在研究中发现,短时间缺血情况下,氧自由基产物MDA 含量明显升高,且升高幅度与缺血时间呈正相关,证明机体内已产生大量的自由基。MDA的急剧升高,正反馈调节抗氧化酶类SOD 和GSHPx 的产生,以抵抗体内的氧化应激压力,使得SOD、GSH-Px 的产生呈现与MDA 相似的趋势,因此可见在缺血1 h 时,模型动物MDA 含量和SOD、GSH-Px活性均高于缺血30 min,且与正常动物有显著差异。另外,在实验过程中发现缺血2 h 时,MDA 含量和SOD、GSH-Px 活性不升反降,结合病理结果和动物临床表现,我们得知,在缺血2 h 时,小肠病理损伤严重,上皮细胞坏死、溃疡、固有层破坏,炎症细胞浸润明显,小肠绒毛高度及黏膜厚度显著降低,且损伤程度较缺血1 h 时要严重,且动物临床状态较差,个别动物肠道肉眼可见出血,出现了动物死亡的情况,正因此,机体对各项刺激的反应性下降,导致MDA 含量和SOD、GSH-Px 活性不升反降的结果出现。病理结果同时显示,缺血30 min 及1 h 均可见小肠组织的病理变化,且变化程度与缺血时间呈正相关性,缺血1 h 更可见小肠绒毛高度及黏膜厚度明显下降,但病变程度均弱于缺血2 h 组。

综上所述可知,缺血30 min,IIRI 模型症状较轻,小肠绒毛高度及黏膜厚度未见明显变化;缺血2 h,动物死亡率较高,且小肠病理损伤十分严重,不适用于IIRI 建模;缺血1 h,可见氧化指标明显变化,MDA 含量显著升高,同时小肠病理变化明显,小肠绒毛高度、黏膜厚度显著降低,炎性细胞轻度浸润,可见IIRI 模型程度适中,相对理想,因此在IIRI疾病研究时,建议采用缺血1 h 再灌注4 h 的条件进行造模。