不同刺激因素诱导的慢性阻塞性肺疾病小鼠模型肺小血管重塑的比较研究

崔莉莉 梅晓峰 卢瑞龙 徐可心 田燕歌

(1.河南中医药大学呼吸疾病中医药防治省部共建协同创新中心,河南省中医药防治呼吸病重点实验室,郑州 450046;2.河南中医药大学中医药科学院,郑州 450046)

肺血管结构和功能的改变是慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)的主要病理特征,可损害气体交换功能、引起肺动脉高压,影响患者预后[1]。研究发现,在轻度COPD患者或肺气肿易感的吸烟人群中即出现肺小血管血流异常,且随疾病进展而恶化[2]。香烟烟雾、细菌等有害物质进入机体,细小颗粒随气体交换进入肺小血管,促进炎症细胞的募集及血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的释放,引起内皮和血管平滑肌增殖,形成肺血管重塑,终致肺动脉高压、肺源性心脏病[3-6]。通过CT 观察发现,肺小血管的改变能反映患者肺气肿程度及是否存在肺动脉高压,且对于判断患者预后具有重要意义[7]。可见,肺小血管改变发生较早,并与COPD疾病进展及预后关系密切。本研究在前期研究基础上[8],比较了在香烟烟雾、细菌及其联合的刺激因素下,不同时间点肺小血管重塑情况,以期为深入研究COPD 合并肺血管病变机制及相关治疗提供模型依据。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物

SPF 级BALB/c 小鼠72 只,雄性,体重为20～22 g,购于北京维通利华实验动物技术有限公司[SCXK(京)2021-0006],并饲养于河南中医药大学动物实验中心[SYXK(豫)2021-0015]。本实验均通过河南中医药大学实验动物福利伦理审查委员会审查(DWLL202003210),并按实验动物使用的3R 原则给予人道的关怀。

1.1.2 细菌

肺炎克雷伯杆菌(46114)由中国生物制品检验鉴定所提供,使用前将细菌浓度调整为5×109CFU/L。

1.2 主要试剂与仪器

红旗渠牌过滤嘴香烟,由河南中烟工业有限责任公司生产,焦油量10 mg,烟气烟碱量0.8 mg,烟气一氧化碳量12 mg。

SABC 免疫组化试剂盒(Boster,批号:16K13E28J0922);DAB 显色试剂盒(Boster,批号:16K04A27);VEGF 抗体 (proteintech,批号:00062384)。动物肺功能检测系统(FinePointe,美国);Leica-DM6000B 光学显微镜及LAS V4.7 照相系统(Leica,德国);Image-Pro Plus(IPP)6.0 专业图像分析系统(Cybernetics,美国);CaseViewer(C.V)2.4 切片浏览分析系统(3D histech,匈牙利)。

1.3 实验方法

1.3.1 动物分组及小鼠模型制备

72 只SPF 级BALB/c 雄性小鼠,适应性饲养7 d 后,通过随机数字法分为4 组:正常组(Normal组)、细菌组(KP 组)、香烟烟雾组(CS 组)、香烟烟雾联合细菌组(CS+KP 组),每组18 只。CS 暴露方法:使用烟熏系统装置进行烟雾暴露,使烟雾浓度达到(3000±500)ppm,每次40 min,每天2 次(早晚各1 次);KP 感染方法:每只小鼠鼻腔滴入20 μL KP 稀释液,每7 d 一次。正常组给予过滤空气加生理盐水滴鼻,CS 组给予香烟烟雾暴露及生理盐水滴鼻,KP 组给予过滤空气和KP 稀释液滴鼻,香烟烟雾联合细菌组,采用上述CS 暴露和反复KP 感染法联合处理。第1～8 周造模,观察至第16 周。分别于第4、8、16 周结束后各组随机选取6 只,进行分批取材。

1.3.2 肺功能测定

第0、4、8、12、16 周末采用全身体积描记系统,检测小鼠肺功能,观察呼气中期流速(50% expiratory flow,EF50)和潮气量(tidal volume,TV)指标。

1.3.3 肺组织病理改变

左肺经10%中性甲醛固定,石蜡包埋切片并采用HE 染色。光学显微镜下观察100 μm≤直径≤300 μm 肺小动脉的形态变化,测量肺血管直径(vessel diameter,VD)、管壁厚度(wall thickens,WT),血管总面积(total area,TA)、管壁面积(wall area,WA=TA-LA)、管腔面积(luminal area,LA),计算管壁厚度占血管直径百分比(WT%=WT/VD×100%)、管壁面积占血管总面积百分比(WA%=WA/TA×100%)及管腔面积占血管总面积百分比(LA%=LA/TA×100%)进行量化分析。

1.3.4 免疫组化学检测血管VEGF 的蛋白表达

肺组织石蜡包埋切片后,进行烤片、脱腊、抗原修复、血清封闭后,加VEGF 一抗(1 ∶5000)4℃过夜,次日滴加二抗、DAB 显色液、苏木素复染后,采用Leica-DM6000B 光学显微镜及LAS V4.7 照相系统进行观察VEGF 血管阳性表达并拍照记录。Image-Pro-Plus6.0 软件计算光密度并量化比较。

1.4 统计学方法

采用SPSS 21.0 统计软件进行各组数据分析。数据处理结果以平均数±标准差()表示;不同组间采用单因素方差分析,符合正态分布且方差齐者采用LSD 分析,方差不齐者采用Dunnett’sT3 进行分析,以P<0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况

实验观察期间,正常组小鼠毛色光亮、呼吸均匀、精神良好且食量正常,CS 组从第8 周出现毛发微黄、精神不振且呼吸浅快,KP 组仅第8 周出现精神不振、食量减少,CS+KP 组从第4 周出现毛发干枯发黄、呼吸急促、精神萎顿且食量减少。各组观察至第16 周,未出现动物死亡现象。

2.2 各组小鼠肺功能变化

第0～16 周,各组小鼠肺功能TV、EF50 随时间均有升高趋势,但正常组升高较为显著,其余组升高缓慢。与正常组比较,CS 组TV 在第8 周显著降低并持续到第12 周,EF50 在第8 周显著降低且持续到第16 周(P<0.05);CS+KP 组TV 在第4 周显著降低并持续到第16 周(P<0.05),EF50 在第8 周显著降低且持续到第16 周(P<0.05);KP 组无显著差异。见表1、表2。

表1 各组小鼠不同时间点TV 的比较(,mL/s,n=6)Table 1 Comparison of TV in each group of mice at different time points

表1 各组小鼠不同时间点TV 的比较(,mL/s,n=6)Table 1 Comparison of TV in each group of mice at different time points

注:与正常组比较,#P<0.05。Note.Compared with normal group,#P<0.05.

表2 各组小鼠不同时间点EF50 的比较(,mL/s,n=6)Table 2 Comparison of EF50 in each group of mice at different time points

表2 各组小鼠不同时间点EF50 的比较(,mL/s,n=6)Table 2 Comparison of EF50 in each group of mice at different time points

注:与正常组比较,#P<0.05。Note.Compared with normal group,#P<0.05.

2.3 各组小鼠肺组织病理变化

正常组各时期镜下观察肺泡结构完整、间隔均匀,无炎性细胞浸润。CS 组第8 周肺泡间隔破裂明显且有炎性细胞浸润持续到第16 周;KP 组第8 周肺泡出现部分破裂融合且有少量炎性细胞浸润,炎症浸润第16 周仍存在;CS+KP 组第4 周肺泡腔已出现不规则扩张融合、炎性细胞浸润并持续到第16周。见图1。

图1 不同时期各组小鼠肺组织病理变化(HE 染色)Figure 1 Histopathological changes of lung in each group of mice in different periods(HE staining)

2.4 各组小鼠肺组织血管结构变化

正常组各时期镜下观察小鼠肺血管未见明显的病理改变,血管管腔形态及管壁厚度正常,未见明显的炎性浸润;CS 组在第8 周,肺小动脉可见中膜增厚、管腔狭窄、周围炎性浸润明显并持续到第16 周;KP 组仅第8 周,肺小动脉出现管壁增厚、管腔狭窄等病理变化;CS+KP 组在第4 周,肺小动脉就已出现中膜增厚且呈肌化、管腔狭窄及大量炎性细胞浸润并持续到第16 周。

与正常组比较,CS 组WT%在第8 周显著升高并持续到第16 周,WA%仅第8 周显著升高、LA%仅第8 周显著降低(P<0.05);CS+KP 组WT%、WA%自第4 周显著升高且并持续到第16 周,LA%自第4周显著降低且持续到第16 周(P<0.05);KP 组WT%仅第8 周显著升高,LA%仅在第8 周显著降低(P<0.05);CS+KP 组较CS 组,WT%在第8 周持续显著升高并持续到第16 周,WA%第16 周显著升高,LA%第16 周显著降低(P<0.05);CS+KP 组较KP 组,WT%、WA%在第8 周持续显著升高且持续到第16 周,LA%在第4 周持续显著降低且持续到第16 周(P<0.05),CS 组较KP 组,WT%仅第8 周升高、LA%仅第8 周降低(P<0.05)。见图2、表3、表4、表5。

表3 各组小鼠不同时间点WT%比较(,n=6)Table 3 Comparison of WT% in each group of mice at different time points

表3 各组小鼠不同时间点WT%比较(,n=6)Table 3 Comparison of WT% in each group of mice at different time points

注:与正常组比较,#P<0.05;与香烟烟雾组比较,∗P<0.05;与细菌组比较,ΔP<0.05。Note.Compared with normal group,#P<0.05.Compared with CS group,∗P<0.05.Compared with KP group,ΔP<0.05.

表4 各组小鼠不同时间点WA%比较(,n=6)Table 4 Comparison of WA% in each group of mice at different time points

表4 各组小鼠不同时间点WA%比较(,n=6)Table 4 Comparison of WA% in each group of mice at different time points

注:与正常组比较,#P<0.05;与香烟烟雾组比较,∗P<0.05;与细菌组比较,ΔP<0.05。Note.Compared with normal group,#P<0.05.Compared with CS group,∗P<0.05.Compared with KP group,ΔP<0.05.

表5 各组小鼠不同时间点LA%比较(,n=6)Table 5 Comparison of LA% in each group of mice at different time points

表5 各组小鼠不同时间点LA%比较(,n=6)Table 5 Comparison of LA% in each group of mice at different time points

注:与正常组比较,#P<0.05;与香烟烟雾组比较,∗P<0.05;与细菌组比较,ΔP<0.05。Note.Compared with normal group,#P<0.05.Compared with CS group,∗P<0.05.Compared with KP group,ΔP<0.05.

图2 不同时期各组小鼠肺血管病理变化(HE 染色)Figure 2 Changes in pulmonary vascular pathology in each group of mice at different periods(HE staining)

2.5 各组小鼠肺组织VEGF 蛋白表达变化

与正常组比较,CS 组VEGF 阳性表达仅第8 周显著增加(P<0.05);CS+KP 组VEGF 阳性表达自第4 周显著升高并持续到第16 周(P<0.05);KP 组VEGF 阳性表达无显著趋势。见图3、表6。

表6 各组小鼠不同时间点VEGF 比较(,n=5～6)Table 6 Comparison of VEGF in each group of mice at different time points

表6 各组小鼠不同时间点VEGF 比较(,n=5～6)Table 6 Comparison of VEGF in each group of mice at different time points

注:与正常组比较,#P<0.05;与香烟烟雾组比较,∗P<0.05;与细菌组比较,ΔP<0.05。Note.Compared with normal group,#P<0.05.Compared with CS group,∗P<0.05.Compared with KP group,ΔP<0.05.

图3 各组小鼠肺组织VEGF 表达变化(IHC)Figure 3 Changes in VEGF expression in lung tissues in each group of mice

3 讨论

COPD 是一种以气流受限、慢性进行性气道炎症为特点的肺部疾病,肺血管病变在COPD 患者中普遍存在[2]。临床研究发现,约30%～70%的COPD患者存在显著肺血管病变,加重疾病恶化程度[9]。此外,肺小动脉缺氧性收缩可促进血管内膜增厚、平滑肌增生,导致血管结构改变,最终形成肺动脉高压[10]。香烟烟雾、环境污染物等多种致病因素可引起肺小血管的改变[11]。香烟烟草中含有大量有毒成分,长期香烟烟雾刺激引起气道平滑肌细胞增殖的同时,还可通过血小板衍生生长因子诱导肺小动脉平滑肌层的增厚、管腔变窄、增加右心室收缩压,从而引起肺血管重构,继发肺动脉高压[12-13]。细菌感染也是COPD 发生发展的重要致病因素,其中,肺炎克雷伯杆菌为常见的病原菌,可导致支气管炎症、气道重塑及肺小动脉管壁增厚明显等病理特征,与患者进展和预后密切相关[14-16]。目前,COPD 模型制备方法包括单一因素诱导的模型,例如CS 暴露[17]、细菌感染[18]、病毒感染[19],及复合因素诱导的模型,例如CS 联合细菌[15,20-21]或病毒感染[8]、CS 联合脂多糖[22]等。课题组前期比较了香烟、细菌、病毒及香烟联合细菌或病毒因素建立的COPD 小鼠模型,发现均可引起肺功能下降、肺组织结构损伤[8]。本研究在此基础上,选取CS、KP 及其联合三种方法诱导COPD 小鼠模型,以肺血管结构变化为主要指标,观察不同诱导因素下肺血管的动态变化,为深入探讨COPD 血管病变机制、药物对肺血管的作用及远后效应评价、药物作用机制研究提供模型依据。

肺功能下降不仅反映气流受限程度,还与肺血管重构程度有关,当肺实质破坏和血管管壁发生异常改变时,损害了肺泡腔中气体交换功能,导致肺功能逐渐下降[23-24]。EF50 作为衡量气道阻力指标,反映小鼠支气管阻塞程度,TV 反映肺通气功能[25-26]。本研究发现,单独香烟烟雾暴露在第8周,TV 明显降低,小鼠出现呼吸浅快,在第16 周仍存在;EF50 在第8 周降低,出现明显气道阻塞并在第16 周仍存在。单独细菌感染EF50、TV 降低并不明显,提示小鼠无明显气道阻力,且呼吸无明显异常。香烟烟雾联合细菌感染在第4 周,TV 明显降低,小鼠即出现呼吸浅快,在第16 周持续存在;EF50 在第8 周降低,出现明显气道阻力且在第16周仍持续存在。说明香烟烟雾或其联合细菌感染可明显降低小鼠肺通气功能,引起气道阻塞,且在去除刺激因素(比如戒烟)后难以逆转。

多种刺激因素导致的缺氧、慢性炎症,促进血管壁分泌VEGF 等细胞因子,并通过肺血管平滑肌细胞表型转化,刺激血管病理性生成,破坏血管内皮屏障,从而出现管壁内膜增厚、管腔狭窄甚至闭塞等病理表现,最终导致肺血管结构重塑[27-30]。本研究以管壁厚度、管壁面积、管腔面积为肺血管重塑指标,并选取直径小于300 μm 的接近于肺小动脉范围的血管,通过测量分析发现,单独香烟烟雾暴露在第8 周,出现肺小动脉管壁增厚、管腔狭窄,VEGF 表达明显增加,第16 周管壁增厚仍存在,而管腔狭窄仅第8 周存在;单独细菌感染仅第8 周出现管壁增厚、管腔狭窄的病理变化;香烟烟雾联合细菌感染4 周即出现肺小动脉管壁增厚、管腔狭窄及VEGF 表达明显现象,并在第16 周仍存在。说明香烟烟雾、细菌及其联合均可引起肺小动脉重塑,但复合因素诱导的模型肺小动脉重塑发生较早,持续时间较长。

综上,香烟烟雾、肺炎克雷伯杆菌及其联合刺激8 周均能诱导小鼠出现肺泡破裂、炎性细胞浸润、肺血管重塑等COPD 病理特征,但各有特点:单独香烟刺激8 周出现肺功能下降、肺泡结构断裂融合,并在第16 周仍存在,但肺血管重塑仅第8 周明显;单独细菌感染肺功能下降不明显,肺组织炎症细胞浸润明显并持续存在,肺泡结构改变及肺血管重塑仅第8 周存在;香烟烟雾联合细菌感染复合刺激4 周即出现肺功能下降、肺泡结构的破坏及肺血管重塑,第16 周仍持续存在。因此,对于COPD 合并肺血管病理机制及药物作用机制的研究可选用单独香烟暴露或者香烟烟雾联合细菌感染模型,对于药物作用特点、远后效应评价的研究选用香烟烟雾联合细菌感染复合模型较为妥当。