中药松弛膏联合运动康复对关节挛缩大鼠关节纤维化ROM 及炎症反应的研究

苗田雨,帕丽达·买买提∗,努尔比亚·克其克,王宁宁,李晶晶,史凌云,夏热帕·阿不都拉,阿斯古丽·图尔荪,

(1.新疆医科大学护理学院,乌鲁木齐 830000;2.新疆医科大学第一附属医院护理部,乌鲁木齐 830000)

关节挛缩(joint contracture)是临床上一种常见的慢性关节疾病,常伴随关节僵硬、畸形、功能受损等症状,是神经肌肉疾病与骨关节疾病的常见并发症[1]。其症状为伴随关节主动或被动活动范围的丧失[2],临床上表现为患者关节活动度(range of motion,ROM)下降,持续的主动及被动活动范围受限[3]及步态异常等功能障碍[4],严重影响患者日常生活自理能力(activity of daily living,ADL)。关节挛缩可分为神经源性挛缩、关节源性挛缩与肌肉源性挛缩[5],其中关节纤维化(arthrofibrosis)在关节挛缩形成中起到重要作用[6]。在纤维化过程中,白细胞介素(interleukin,IL)6(IL-6)和17(IL-17)及转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGFβ1)引起的细胞因子失衡起关键作用[7-9]。细胞外基质的大量沉积是纤维化的病理特点之一[10],炎症细胞分泌细胞趋化因子,使细胞外基质过度沉积[11],TGF-β1 信号传导也参与细胞外基质的发育、迁移和沉积[12],促使细胞外基质合成增加,最终关节囊内形成纤维化瘢痕组织以及纤维粘连。关节纤维化主要采用药物干预、物理干预以及外科干预等综合康复方法,致力于恢复关节的病理结构,改善关节活动度[13]。然而,目前大多关节纤维化的治疗效果不佳。在本课题组的前期研究中发现,中药松弛膏外敷结合西医康复护理疗法能有效改善患者的下肢关节活动度[14],减轻炎症反应[15],但其改善病理变化的机制尚不清楚。本研究通过采用中药松弛膏联合跑台运动干预的综合康复干预方法,探讨其对关节挛缩关节纤维化大鼠中ROM、IL-6、IL-17 和 TGF-β1 表达的影响。

1 材料和方法

1.1 实验动物

44 只6～8 周龄,SPF 级,体重为180～220 g 的雄性Wistar 大鼠,购自新疆医科大学实验动物中心[SCXK(新)2018-0003],实验场所为新疆医科大学实验动物中心屏障环境动物实验室[SYXK(新)2019-0004],饲养室照度150～200 lx,室温控制在18℃～22℃,相对湿度:50%±10%。动物房进行严格消毒,正常昼夜交替节律。本实验已通过新疆医科大学第一附属医院伦理委员会的审核(20200326-03),并按实验动物使用的3R 原则给予实验动物人道的关怀。

1.2 主要试剂与仪器

本课题组研制的中药松弛膏(专利号2018114781048),由多种具有消炎退肿、解痉祛风、止痛活血作用的动物油及中草药成分组成,该药物每500 g 由原料亚麻籽20 g、没药20 g、葫芦巴20 g、羊乳香20 g、药蜀葵子20 g、洋甘菊20 g、秋水仙20 g、马油200 g 和牛骨髓200 g 组成。其具有副作用小、对机体无创伤、使用便捷的特点,对消肿抗炎、软筋生肌、润肤防腐、化脓愈伤有积极作用。

义齿聚托聚合物自凝牙托粉(上海贝琼齿材有限公司);义齿聚托聚合物自凝牙托水(上海贝琼齿材有限公司);苏木素(Sigma 公司,美国);伊红(国药集团化学试剂公司);IL-6 试剂盒(江莱生物);IL-17 试剂盒(江莱生物);TGF-β1 试剂盒(江莱生物);戊巴比妥钠(默克公司,德国);0.9%生理盐水(利尔康医疗科技);碘伏(利尔康医疗科技)。

FT-200 型动物跑步机(成都泰盟软件有限公司);0.8 mm 带螺纹定制骨牵引针(天津希翼器械公司);骨科电钻(盐城奥瑞公司);冰冻切片机(LEICA 公司,德国);液氮罐(乌鲁木齐制氧厂);手持式组织匀浆机(PRO Scientific 公司,法国);超声波破碎仪(宁波新芝);普通光学显微镜(尼康公司,美国);电子天平(PL403)(Mettler Toledo 公司,美国);精密电子天平(Sartorius 公司,德国);超低温冰箱(994)(Thermo Scientific 公司,美国);台式低温冷冻高速离心机(Thermo Scientifict 公司,美国)。

1.3 实验方法

1.3.1 模型制备方法

按照Nagai 等[16]法,复制本次课题所需的关节挛缩模型,具体步骤如下:采用随机数字表法将44只大鼠分为正常对照组(normal control group,NC组)8 只和模型组36 只。取模型组36 只大鼠,腹腔注射3%戊巴比妥钠(3 mg/kg)深度麻醉后将左后肢剃毛并消毒;分别在股骨和胫骨1/2 和1/3 处进针,将0.8 mm 带螺纹的克氏针垂直穿过但未穿破内侧皮肤,再将外露的克氏针剪至超出皮肤约1.8 cm;用量角器使股骨和胫骨夹角固定于45°,用无菌软铁丝连接股骨和胫骨外露的克氏针;将自凝牙托粉和自凝牙托水按比例混合,包裹软铁丝和外露的克氏针。固定结束后对所有大鼠进行X 线拍摄(如图1),36 只大鼠固定成功。复制关节挛缩模型3 周后,随机抽取2 只大鼠,处死大鼠后剥离关节囊滑膜,进行苏木精-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色,判断已发生挛缩,拆除固定装置,发现2 只大鼠骨折,最终32 只大鼠制模成功。

图1 复制关节挛缩模型后大鼠X 线拍摄Figure 1 After the joint contracture model was reproduced,the rats were photography by X-ray

1.3.2 HE 染色验证模型制备是否成功

常规包埋切片,脱蜡、脱二甲苯、返蓝、染色、封片,在光学显微镜下观察切片形态并记录。

1.3.3 干预方法

采用随机数字表法将32 只大鼠分为模型对照组(model control group,MC 组)、中药松弛膏干预组(songchi ointment intervention group,SC 组)、跑台运动干预组(running platform exercise intervention group,RE 组)、中药松弛膏+跑台运动干预组(songchi ointment+running platform exercise intervention group,SR 组)。

(1)MC 组:去除固定装置后,不给予特殊干预;(2)SC 组:去除固定装置后,在造模侧膝关节周围涂抹中药松弛膏约18 g 并采用指揉法按摩3 min,每日1 次,1 周6 次,共6 周;(3)RE 组:将大鼠置于跑步机上,结合已有文献报道[15],将速度设定在1 km/h,每次20 min,每日1 次,1 周6 次,共6 周;(4)SR 组:先按照运动康复干预组的方法进行跑台训练,训练结束后按照中药松弛膏干预组的方法进行药物涂抹与按摩,每日1 次,1 周6 次,共6 周。

1.3.4 ROM 的测量

分别于取出固定装置后、干预42 d 后对所有大鼠进行X 片拍摄,给每只大鼠腹腔注射3%的戊巴比妥钠(3 mg/kg)进行深度麻醉,右侧卧位置于X片机台上并左后肢踝关节悬挂0.5 N 砝码固定以保证每一只大鼠受力均匀,砝码必须与大鼠正中线平行悬挂,避免接触任何物品,以保证每一只大鼠均使用同等大小的拉力,X 光下拍摄股骨与胫骨夹角,并用Image J 软件测量大鼠左膝关节ROM。

1.3.5 ELISA 检测IL-6、IL-17、TGF-β1 含量

干预42 d 后进行取材,取材前24 h 禁食不禁水,腹腔注射3%的戊巴比妥钠麻醉后,采大鼠腹主动脉血室温静置2 h 后以3000 r/min 离心10 min 并抽取上清液置于-80℃冰箱内;取各组大鼠血清样本,根据试剂盒说明书要求处理样本后,采用酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测各组大鼠血清中IL-6 及IL-17 含量;取大鼠滑膜组织液,由于大鼠滑膜组织液量极少,不足以达到检测的最低样本量,因此添加灭菌用水稀释至10%,采用ELISA 检测试剂盒检测TGF-β1含量。

ELISA 检测方法:按照ELISA 试剂盒说明书检测,从室温平衡60 min 后的铝箔袋中取出所需板条;配置标准液;标准品孔、样品孔内分别加入标准品、待测样本50 μL,空白孔不加;每孔加入50 μL的抗体工作液后孵育;洗涤后每孔加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测抗体100 μL;加酶后孵育加终止液,读取吸光度,制作标准曲线。

1.4 统计学方法

采用SPSS 26.0 软件(美国IBM 公司)进行统计分析。经正态性检验和方差齐性检验后,服从正态分布的计量资料用平均数±标准差()表示,多组间均数比较采用单因素方差分析,两组间比较采用组间t检验,检验水准取α=0.05,P<0.05 为有统计学意义。实验分析图使用 Graphpad prism 9.02 绘制。

2 结果

2.1 干预前、模型制备后HE 染色验证结果

模型制备3 周后,通过HE 染色观察大鼠关节囊滑膜发现,大量炎性细胞浸润,纤维组织排列紊乱,滑膜内壁可见增厚萎缩等改变,复制大鼠关节挛缩模型成功(如图2)。

图2 模型制备后大鼠关节囊滑膜组织HE 染色观察(滑膜)Figure 2 Observation of synovial tissue of rat joint capsule after model preparation(Synovial membrane)

2.2 各组大鼠左膝关节ROM 比较

取出固定装置后、实验干预前NC 组和模型组大鼠ROM 比较(见表1):与NC 组大鼠ROM(113.35±6.56)°相比,模型组大鼠ROM(97.59±7.99)°明显下降,差异具有统计学意义(t=4.861,P<0.05),故复制大鼠关节挛缩模型成功。

表1 正常对照组与模型组在取出固定装置后、实验干预前ROM 比较(°,)Table 1 Comparison of ROM between normal control group and model group after removal of fixed device and before experimental intervention

表1 正常对照组与模型组在取出固定装置后、实验干预前ROM 比较(°,)Table 1 Comparison of ROM between normal control group and model group after removal of fixed device and before experimental intervention

注:正常对照组一只大鼠依从性较差,数据淘汰:经2～3 次麻醉药追加达不到麻醉效果,导致达不到实验要求,因此淘汰。Note.Compliance of a rat in the normal control group was poor,and the data were eliminated: the anesthesia effect could not be achieved after 2～3 times of anesthesia addition,which led to the failure to meet the requirements of the experiment,so it was eliminated.

2.3 干预前、干预42 d 后各组大鼠ROM 比较

干预42 d 后RE 组与SR 组比较,t=-2.307,P<0.05,与MC 组比较,t=2.788,P<0.05;MC 组与SR组比较,t=-5.817,P<0.05,与SC 组比较,t=-3.222,P<0.05,差异均具有统计学意义;RE 组与SC 组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。与干预前相比(见表2),干预42 d 后SC 组、RE 组、SR组ROM 均较干预前显著提高,差异具有统计学意义(如图3)。

图3 取出固定装置后、干预42 d 后大鼠X 线拍摄Figure 3 After removing the fixation device and 42 days after intervention,the rats were photographed by X-ray

表2 各组大鼠在干预前、干预42d 后R OM 比较(°,)Table2 ROM com parison of ratsinea chgroup be fore and 42 days after intervention

表2 各组大鼠在干预前、干预42d 后R OM 比较(°,)Table2 ROM com parison of ratsinea chgroup be fore and 42 days after intervention

注:NC 组一只大鼠依从性较差,数据淘汰 ;NC 组、MC 组、RE 组各一只大鼠麻醉死亡。Note.Compliance of one rat in NC group was poor and the data were eliminated.One rat in NC group,MC group and RE group died of anesthesia.

2.4 各组大鼠IL-6、IL-17 水平

通过两两组间比较发现(如图4),MC 组IL-6(1.184±0.056)pg/mL、IL-17(0.703±0.019)pg/mL含量均较NC 组显著升高(P<0.01);RE 组IL-6(0.952±0.010)pg/mL、IL-17(0.642±0.009)pg/mL含量,SC 组IL-6(0.952±0.012)pg/mL、IL-17(0.625±0.005)pg/mL 含量,SR 组IL-6(0.905±0.005)pg/mL、IL-17(0.610±0.002)pg/mL 含量均较MC 组明显降低,组间差异均具有统计学意义(P<0.01);SR组IL-6 及IL-17 含量均数显著低于SC 组、RE 组,组间差异均具有统计学意义(P<0.05)。

图4 各组大鼠血清样本IL-6 及IL-17 含量比较Figure 4 Comparison of IL-6 and IL-17 contents in serum samples of rats in each group

2.5 各组大鼠滑膜液中TGF-β1 的含量

通过两两组间比较发现(如图5),MC 组TGFβ1 含量(0.255±0.004)ng/mL,较NC 组(0.236±0.001)ng/mL 显著升高,差异具有统计学意义(P<0.01);SC 组(0.248±0.003)ng/mL、RE 组(0.250±0.002)ng/mL 及SR 组(0.242±0.005)ng/mL TGFβ1 含量均较模型对照组显著降低,组间差异均具有统计学意义(P<0.01);SR 组TGF-β1 含量均数显著低于SC 组、RE 组,组间差异均具有统计学意义(P<0.05)。

图5 各组大鼠滑膜液TGF-β1 含量比较Figure 5 Comparison of TGF-β1 content in synovial fluid of rats in each group

3 讨论

随着人类社会的不断发展,交通事故频繁发生、户外运动持续增多、生活方式改变使慢性病的患病率逐年升高,骨关节疾病发生率也呈逐年上升趋势,尤其是关节挛缩患者大幅增加。关节固定是临床上引起关节挛缩最常见的原因[17]。当骨折、关节脱位、韧带损伤发生后,常采用关节固定[17]。然而,不正确的固定或过长的固定时间使关节缺乏活动,引起组织的退变或萎缩性改变,如关节周围软组织纤维化[18],导致关节挛缩[19]、关节活动受限等,其极大降低患者生活质量,给患者重回社会带来严峻挑战。目前临床上治疗关节纤维化的方法很多,但其治疗效果均不理想,手术治疗获益与风险并存,药物治疗的病理机制尚需进一步深入研究[13]。自各国相继发现新型冠状病毒肺炎(coronavirus disease 2019,COVID-19)以来,慢性非传染性疾病患者的用药、诊疗及康复需求得不到满足[20]。在这种形势下,无需设备及专业人员便可执行的康复方案的独特优势尤为凸显。近年来,中药疗法的使用越来越广泛,中药外敷以省时省力、贴敷方便、副作用小、可与其他康复方案联合应用的独特优势备受青睐[21-22]。因此本研究采用课题组成熟的关节挛缩动物模型,将大鼠制动3 周后拆除外固定,通过中药松弛膏联合跑台运动康复的干预方法,探究其对关节挛缩大鼠关节纤维化的影响。

本研究在模型制备成功后、干预前测量大鼠膝关节ROM,结果显示,与NC 组相比,模型组大鼠关节活动度显著减小,进一步说明关节固定是关节挛缩发生的首要原因。干预42 d 后,测量大鼠膝关节ROM,结果显示,SC 组、RE 组、SR 组 ROM 均较模型对照组显著提高,提示适宜的运动有利于关节功能的恢复,维持正常的关节活动,对改善关节功能减退、关节畸形具有重要意义。中药松弛膏中主要成分秋水仙碱可抑制炎性因子释放,阻断中性粒细胞释放至关节腔内,消除关节肿胀[23-24]、没药与乳香具有消肿生肌、活血止痛的功效[25-27]、亚麻籽中富含的omega-3 可减轻炎症、激活肌纤维细胞加速肌肉再生[28],对改善大鼠ROM 起到一定疗效。本研究结果显示,中药松弛膏联合跑台运动康复干预组ROM 显著高于单纯跑台运动康复干预组与中药松弛膏干预组,提示中药松弛膏与运动疗法具有协同作用,可进一步改善关节挛缩关节纤维化大鼠的ROM。

关节挛缩和纤维化是复杂的病理生理过程,与多种细胞因子驱动的炎症反应有关,研究发现[29-30],IL-6、IL-17 在各种疾病和组织中显示出纤维化活性。IL-6 由巨噬细胞及T 细胞产生,可促进中性粒细胞聚集于炎性反应部位,释放蛋白酶及氧自由基[31],介导免疫病理损伤参与纤维化发展,反应纤维化程度[32]。IL-17 主要作用于间充质来源的细胞[33],分泌各种前炎性细胞因子及抗菌肽,诱导内质网应激,促进上皮细胞损伤,引起纤维化。TGF-β1 是纤维化的主要参与物,其由巨噬细胞、内皮细胞产生,通过自分泌、旁分泌调控细胞生长,是最主要的致纤维化因子之一[34]。在早期阶段,组织通过大量释放TGF-β1[35],与多种细胞相互作用[36],形成复杂的纤维化网络。在本研究中,MC 组TGF-β1 含量较正常对照组显著升高,表明在关节纤维化的形成中,TGF-β1 发挥着重要作用。在复杂的纤维化网络中,TGF-β1 通路被广泛认为可诱导组织的纤维化[37]。

本研究中,模型制备当日大鼠关节囊滑膜HE染色显示,纤维组织排列紊乱,滑膜内壁可见增厚萎缩等改变,大量炎性细胞浸润,提示模型制备成功。干预42 d 后模型对照组炎症因子水平显著高于其余四组,提示单核吞噬细胞、中性粒细胞聚集,引起并加重炎症与纤维化活性。运动疗法是防治关节纤维化的有效手段,研究表明,作为重要的有氧运动方式之一,跑台运动对炎症因子水平、制动引起的关节挛缩关节纤维化有明显的改善作用[38-40],故本研究采用跑台训练,结果显示RE 组IL-6、IL-17 以及TGF-β1 含量较MC 组显著降低,运动疗法可显著改善炎症反应及纤维化。在中药松弛膏干预时采用按摩手法,促进关节周围组织血液流通,松解组织粘连,放松肌肉[41],有利于药物吸收,充分发挥药物成分抗炎消肿,活血止痛的效用。在干预42 d 后,SR 组的炎症因子含量、TGF-β1 含量显著低于MC 组、SC 组及RE 组,提示中药松弛膏联合运动疗法能通过抑制炎症因子分泌,降低大鼠关节纤维化水平。

本研究为中医药联合运动的干预方案对关节挛缩关节纤维化的防治提供新思路,后续研究中,TGF-β/Smad 信号传导调控中药松弛膏联合跑台运动康复的干预方案对关节挛缩大鼠的关节纤维化的机制值得进一步研究。综上所述,中药松弛膏联合跑台运动康复的干预方案可通过改善关节活动度,减轻炎症因子释放,减少TGF-β1 的分泌来改善关节挛缩大鼠的关节纤维化。因此,通过中药松弛膏联合跑台运动康复干预对关节挛缩大鼠关节纤维化中IL-6、IL-17 和 TGF-β1 表达的影响研究,正确认识该疾病的康复模式,制定合理的康复方案,并采取有针对性的干预措施,对于提高这类患者生活质量及生存率至关重要。