利用液质联用技术分析高温处理对人参皂苷的转化规律

张语迟，刘箬瑶，刘春明，李赛男

(长春师范大学中心实验室，吉林 长春 130032)

人参(PanaxginsengC．A．Mey)是我国传统的药材，用药历史已有两千多年，其中人参皂苷是其有效成分之一，在抗肿瘤、抗衰老、益智、强心及造血等方面具有较强的药理活性[1-5]。人参的常压蒸制品称为“红参”，由于在蒸制过程中皂苷发生转化，因此红参与人参在临床上具有不同的疗效。人参经过高压蒸制皂苷会进一步发生转化，生成了常压蒸制时所没有的皂苷，因此可以进一步地改变人参的临床药效。

近年来，液质联用技术已被广泛用于皂苷类化合物的快速分析研究[6-9]。该技术集液相色谱对复杂体系的高分离能力和质谱独特的选择性、灵敏度、相对分子质量及结构信息于一体，特别是电喷雾(ESI)技术，仅需要微量的样品，在短时间内就能获取化合物结构和相对分子质量信息，为研究热不稳定和极性较大的化合物提供了有利的分析方法[10-12]。因此，本文利用液质联用技术对经过高温处理的人参与未经过处理的对照药材进行了系统研究，并重点对高温处理前后人参皂苷的转化规律进行了研究。为人参炮制及加工过程中人参皂苷的转化提供了理论基础。

1 实验部分

1.1 实验材料与仪器

鲜人参购自长春市御真堂药店，由长春师范大学张语迟副教授鉴定，为五加科植物人参的新鲜根和根茎。人参皂苷标准品Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re、Rg1(吉林大学基础医学院，批号为Rb1：20201105；Rb2：20200815；Rc：20201205；Rd：20210520；Re：20201020；Rg1：20201009)，乙腈、醋酸为色谱纯(美国Thermo-Fisher公司，批号为乙腈：150941；醋酸：172036)。

Waters 2695型高效液相色谱仪，配备Waters 2996 diode array detector检测器 ；Finnigan LCQTM型电喷雾离子阱质谱仪(美国Thermo-Finnigan公司)；高压蒸锅(力辰科技，LHS-12B型)。

1.2 实验方法

1.2.1 HPLC-ESI-MS分析条件

色谱条件：色谱柱为日本资生堂Shiseido-CAPCELL，C18-ODS (250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相A为乙腈，流动相B为0.2%醋酸水溶液。洗脱条件为 0～50 min：25%～50%A、75%～50%B；50～140 min：50%～90%A、50%～10% B；140～150 min：90%～100%A、10%～0 B。流速：0.5 mL/min；检测波长：195 nm；柱温：40℃；进样量:10 μL。质谱条件为喷雾电压：4.5 kV，金属毛细管温度：250℃，鞘气为N2，压力为680 kPa，辅助气体为He, 其压力为100 kPa，分析条件采用负离子模式，扫描范围为：50～2 000。

1.2.2 样品制备

分别称取经120℃蒸制3 h的人参样品与未经过蒸制的对照药材各2 g，均加入30 mL三氯甲烷置索氏提取器中加热回流2 h，然后将2份粉末倒入50 mL锥形瓶中，均加入40 mL饱和正丁醇进行超声提取，均在30℃、500 W的条件下超声提取1 h，滤过，滤液常压蒸干。用甲醇、吡啶定容于10 mL量瓶中，备用。

2 结果与讨论

对未经蒸制的人参与120℃下蒸制3 h的样品中的人参皂苷的转化规律进行了研究。结果表明，经过蒸制的人参与对照药材所含皂苷种类与含量明显不同，利用液相色谱-电喷雾质谱联用技术，在负离子模式下对皂苷转化规律进行了系统研究，其未经蒸制的人参与经过蒸制的人参液相色谱图见图1和图2。

图1 未经蒸制的人参与总离子流图

图2 120℃下蒸制的人参与总离子流图

结果表明，在经过蒸制的人参中共检测到24个主要化学成分，利用液-质联用技术分析化合物1—24的质谱数据，结果见表1。利用该数据结合图1和图2可以直观地分析蒸制过程中皂苷的转化情况。

表1 人参皂苷的液质联用数据

续表

结果表明，经过高温蒸制的人参皂苷种类与含量均发生明显的变化，最大的特征在于人参皂苷Re、Rg1、Ac-Rb1、Rc、Rb2、Rb3、Rd、Rs1、Rs2含量减少，而人参皂苷Rg6、F4、Rk3、Rh4、20S-Rg3、20R-Rg3、Rk1、Rg5、20S-Rh1、20R-Rh1含量显著增多，可以通过质谱信息并结合人参皂苷结构分析人参皂苷的转化过程。

人参皂苷Re为三醇型皂苷，在皂苷元3位上连接羟基，6位上连接葡萄糖基，在20位上连接葡萄糖基和鼠李糖基。由于连接6位葡萄糖基的端基碳为仲碳糖基，性质较稳定，而20位连接双糖基的端基碳为叔碳糖基，性质较活泼，在高温蒸制的过程中20位的双糖基发生水解，将原来的双糖基由羟基取代。从而生成了人参皂苷Rg2，但是人参皂苷Rg2的含量并没有随着蒸制的进行而上升，原因在于人参皂苷的20位叔碳的不稳定性，在蒸制过程中Rg2又进一步发生了转化，在三醇型皂苷20/22位之间和20/21位之间发生了脱水反应。生成了不饱和的人参皂苷Rg2，即人参皂苷F4与Rg6。反应过程见图3。

图3 人参皂苷Re转化为人参皂苷F4和Rg6的原理图

同理，人参皂苷Rg1也为三醇型皂苷，在皂苷元3位上连接羟基，在6位与20位上均连接葡萄糖基。在高温蒸制的过程中20位的双糖基发生水解，将原来的双糖基由羟基取代。从而生成了人参皂苷Rh1，在蒸制过程中Rh1又进一步发生了转化，在三醇型皂苷20/22位之间和20/21位之间发生了脱水反应。生成了不饱和的人参皂苷Rh1，即人参皂苷Rk3与Rh4。此外，高温蒸制后产生了17、18、19、20、21、22、23、24号8个色谱峰，经液质联用技术并结合色谱相对保留时间确定为人参皂苷20S-Rg3、20R-Rg3、20S-Rs3和 20R-Rs3、Rk1、Rg5、20S-Rh1、20R-Rh1。人参皂苷Rs1与人参皂苷Rs2为二醇型皂苷，在A型皂苷元3位上均连接双葡萄糖基和一个乙酰基，在20位分别连接葡萄糖-吡喃型阿拉伯糖和葡萄糖-呋喃型阿拉伯糖，在高温蒸制的过程中20位的双糖基发生水解，将原来的双糖基由羟基取代。从而生成了人参皂苷Rs3。

除人参皂苷Rs1和Rs2外，人参中另含有大量的二醇型皂苷，包括人参皂苷Ra1、Ra2、Ra3、Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd。这类皂苷结构的共同特点为均在3位上连接双葡萄糖基，区别在于在20位连接的糖基不同，经过高温蒸制时20位叔碳糖连接的糖基发生水解，各种二醇型皂苷20位原来的糖基均由羟基取代，从而所有的二醇型皂苷在高温蒸制时均产生了同样的皂苷，即3位上连接双葡萄糖，20位上连接羟基，即人参皂苷20S-Rg3和20R-Rg3。同理，在生成的过程中由于20位碳不稳定可以脱去一分子水生成不饱和的人参皂苷20S-Rg3和20R-Rg3，即人参皂苷Rk1和Rg5，由于二醇型人参皂苷水解产物均为人参皂苷20S-Rg3、20R-Rg3、Rk1和Rg5，导致该四种产物含量极高，反应过程见图4。

图4 人参皂苷Rb1、Rb2、Rc、Rd转化为人参皂苷20S-Rg3、20R-Rg3、Rk1和Rg5的原理图

为了验证该信息，选取人参皂苷Rb1、Rb2、Rc、Rd标准品各2 mg，混合后用10 mL水溶解，于120℃处理2 h，处理结束后将皂苷标准品的蒸制品取出，将水蒸干，用甲醇定容于10 mL量瓶中，电喷雾质谱进行分析。皂苷标准品蒸制后产生了荷质比为783.55和765.55离子，为人参皂苷20S-Rg3、20R-Rg3、Rk1和Rg5。

3 结论

120℃处理人参可以改变人参皂苷种类与含量，人参皂苷Re、Rg2水解为人参皂苷Rg6和F4，人参皂苷Rg1水解为Rk1、Rk3和Rh4，二醇型人参皂苷Rs1和Rs2水解为人参皂苷Rs3，除人参皂苷Rs1和Rs2外，其余人参皂苷均水解生成人参皂苷20S-Rg3、20R-Rg3、Rk1和Rg5。其原理在于人参皂苷元3位与6位的端基碳为仲碳糖基，性质较稳定，在高温处理时不发生水解，而皂苷元20位端基碳为叔碳糖基，性质不稳定，在高温处理时发生水解，将20位碳上连接的糖基全部水解掉，在水解的同时伴随着脱水反应，故而生成了一系列不饱和皂苷。利用液质联用技术是研究人参皂苷类化合物的快捷、准确的方法，可以实现提取物中皂苷类化合物的分离和分析同步完成，适合复杂提取物中化学成分的快速分析。