多肽间非共价作用的质谱研究

蒲 玲，胡子峰，李 萌，朱佳奇，丁传凡

(1.上海市质量监督检验技术研究院，上海 201114；2.宁波大学材料科学与化学工程学院，质谱技术与应用研究院，浙江 宁波 315211)

在生物分子体系中非共价作用普遍存在，是构成分子识别的基础[1]。通过非共价作用可以形成复杂的超分子体系，因此从分子水平上深入理解分子间相互作用具有重要的理论意义和现实的应用价值[2]。利用分析检测技术获取非共价复合物的结构信息[3-4]，如结合类型、结合比、结合强度、结合位点、结构的动态变化等是研究超分子的关键问题之一。

目前，研究非共价复合物的方法主要有光谱法[5-6]、色谱法[7]、超离心技术以及核磁共振(NMR)、X-射线晶体衍射法等。质谱因灵敏度高、能检测大分子质量物质，且样品用量少、图谱信息丰富等特点，可用于研究生物分子[8-9]，使其在非共价复合物研究中起着重要作用[10-15]。电喷雾电离(ESI)过程极其温和，可对极性大分子通过脱除溶剂并离子化成气相完整离子，而极少发生碎裂[16-17]，在气相条件下仍能保持非共价结合。用电喷雾质谱(ESI-MS)可以容易地获得非共价复合物的化学计量、亲和力以及结合性质，只要控制好ESI条件，便可以用ESI-MS探索更多类型的非共价复合物[13,15,18-19]。

各种复杂生物分子高级结构的形成和功能发挥都是不同弱相互作用力协同作用的结果[20]，如DNA和RNA的双螺旋结构、多肽和蛋白质的二级及高级结构、生物膜的形成与稳定、酶的高级结构与功能发挥等，而且在生物分子的高级结构中二硫键有着非常重要的作用[21]。蛋白质的性质和功能由三维构象及折叠状态决定，要深入了解蛋白质的生物活性必须要研究蛋白质的三维结构，而作为组成蛋白质单位的多肽链之间的相互作用，可以为研究蛋白质的三维结构提供帮助[22-23]。

本工作以X-射线晶体衍射的蛋白质三维结构数据作为多肽序列的来源[24]，计算多肽间的空间距离。当距离小于阈值，则假定2个多肽之间有相互作用，人工合成假定有相互作用的多肽，并用ESI-MS研究多肽之间相互作用的情况。通过改变肽链的长度和肽链氨基酸序列来研究巯基、疏水作用和氢键对多肽非共价作用的影响。

1 实验部分

1.1 仪器与装置

LCQ型电喷雾离子阱质谱仪：美国Finnigan公司产品，配有电喷雾电离源、TSP AS3000自动进样器、Xcalibur数据分析软件。

1.2 材料和试剂

多肽(五肽和九肽)：上海吉尔化学公司产品，详情列于表1。甲醇、乙腈、醋酸：均为分析纯，国药集团公司产品。

表1 多肽信息表Table 1 Information of peptides

1.3 实验条件

1.3.1质谱条件 电喷雾离子源；喷雾电压4 kV；毛细管温度200 ℃；毛细管电压20～50 V(实测值1～10 V)；套管透镜补偿电压0～5 V；透镜电压-16 V；多路直流电压1：3 V；多路直流电压2：-7 V；多路射频电压幅值400。

1.3.2进样器条件 进样速度3 μL/min。

1.4 样品制备

按照表2将多肽A、B以摩尔比1∶1混合，混合后单个肽的浓度均为2×10-5mol/L，混合溶液在室温下放置反应12 h后，用电喷雾电离离子阱质谱仪(LCQ型)分析样品。

表2 多肽混合作用组合表Table 2 Combination of peptide mixtures

2 结果和讨论

2.1 多肽间作用质谱图

五肽AK-5与ED-5混合作用后，无非共价复合物质谱信号，表明未形成非共价复合物，示于图1a。Ⅱ-5与IP-5相互作用得到较强的非共价复合物质谱信号，示于图1b。

注：a.AK-5与ED-5；b.Ⅱ-5与IP-5图1 改变五肽序列前，五肽-五肽混合溶液质谱图Fig.1 MS spectra of pentapeptide-pentapeptide mixtures before the sequence changed

改变五肽的氨基酸序列，研究巯基、疏水作用和氢键对五肽相互作用的影响。AK-5(Ala-Val-Ile-Phe-Lys)序列不变，用不含巯基侧链的异亮氨酸Ile替换ED-5(Glu-Ile-Cys-Ala-Asp)中含巯基侧链的半胖氨酸Cys，氨基酸序列变为ED′-5(Glu-Ile-Ile-Ala-Asp)，AK-5与ED′-5混合作用，研究其质谱行为。Ⅱ-5序列不变，用侧链只有H原子的甘氨酸Gly分别替换IP-5(Ile-Phe-Thr-Thr-Pro)中的苯丙氨酸Phe和苏氨酸Thr，替换氨基酸后的五肽序列分别为IP′-5(Ile-Gly-Thr-Thr-Pro)和IP″-5(Ile-Phe-Gly-Thr-Pro)，Ⅱ-5分别与IP′-5和IP″-5混合作用，研究2组五肽相互作用的质谱表现。肽链序列改变前后，五肽分子的结构式示于图2。

改变序列后，AK-5与ED′-5、Ⅱ-5与IP′-5、Ⅱ-5与IP″-5混合溶液的质谱图分别示于图3a、3b、3c。

增加肽链中羟基和疏水基团，研究肽链加长对多肽相互作用的影响，加长肽链前后多肽分子的结构式示于图4。增长肽链后，五肽与九肽混合作用后的质谱图示于图5。其中，AK-5与ED′-9、AK′-9与ED-5混合溶液的质谱图分别示于图5a、5b，均未得到非共价复合物的质谱峰。

图4 肽链增长前后，多肽结构式Fig.4 Structures of polypeptides before and after the peptide chain lengthened

注：a.AK-5与ED-9；b.AK-9与ED-5图5 五肽-九肽混合溶液质谱图Fig.5 MS spectra of pentapeptide-nonapeptide mixtures

2.2 反应产率计算

2个多肽之间的相互作用可以描述为A+B→AB，反应产率[25]由式(1)计算：

(1)

其中，Icomplex和Ipeptide 1分别为复合物和其中1个多肽的质谱强度，本文计算Ipeptide 1时选择质谱强度较强的多肽信号，结果列于表3。

表3 肽-肽相互作用生成复合物的产率Table 3 Productivity of peptide-peptide complexes

根据质谱数据计算得到的产率可用来定性判断任意2个多肽间相互作用的强弱。其中，AK-5与ED-5无非共价结合，将ED-5序列改为ED′-5后，与AK-5非共价作用增强，分别将AK-5和ED-5增长为九肽AK-9和ED-9，五肽与九肽(AK-5与ED-9，AK-9与ED-5)非共价结合无明显增强。Ⅱ-5与IP-5之间的作用最强，改变IP-5序列后，IP′-5与Ⅱ-5、IP″-5与Ⅱ-5相互作用较IP-5与Ⅱ-5的非共价作用均减弱。

2.3 实验结果分析

在质谱数据中发现，ED-5容易形成2分子自我结合的一价质谱峰或二价质谱峰，示于图6。ED-5的结构(如图2)中带有1个巯基，2个ED-5分子中的巯基容易相互作用形成二硫键。

图6 ED-5一价峰(a)和二价峰(b)的质谱图Fig.6 MS spectra of monovalent (a) and bivalent (b) peak of ED-5

AK-5与ED-5混合后无相互作用，将ED-5(Glu-Ile-Cys-Ala-Asp)中的极性氨基酸半胱氨酸Cys换成疏水氨基酸异亮氨酸Ile后形成ED′-5(Glu-Ile-Ile-Ala-Asp)，AK-5与ED′-5之间的作用加强，产率明显增大。一方面是由于替换了ED-5中带有巯基的半胱氨酸Cys，ED-5本身不能再相互作用形成二硫键二聚物，有足够的游离氨基酸与AK-5相互作用形成复合物；另一方面是由于替换为疏水的氨基酸，加强了多肽之间的疏水作用，更有利于非共价复合物的形成。

通过增加五肽AK-5和ED-5肽链的长度研究加长肽链对多肽相互作用的影响。肽链加长后，多肽分子间的氢键作用和疏水作用都相应增强，但五肽和九肽非共价复合物的质谱信号无明显增强，表明巯基的阻碍作用强于加长肽链带来的疏水和氢键的增强作用。这是因为多肽结构中巯基的存在阻碍多肽间的相互作用，同时含巯基侧链的肽链本身更容易形成二价峰，电荷的增多会抑制多肽间接近形成复合物，增强多肽分子间的氢键和疏水作用后，巯基的阻碍作用仍占主要地位，五肽与九肽之间的非共价作用并无明显增强。

五肽Ⅱ-5和IP-5之间的作用较强，因此通过改变IP-5氨基酸序列来研究疏水侧链和氢键对多肽相互作用的影响。如表3所示，五肽Ⅱ-5和IP-5相互作用的产率约为7.6%。Ⅱ-5序列不改变，改变IP-5(Ile-Phe-Thr-Thr-Pro)的序列为IP′-5(Ile-Gly-Thr-Thr-Pro)和IP″-5(Ile-Phe-Gly-Thr-Pro)，Ⅱ-5分别与IP′-5、IP″-5混合作用。Ⅱ-5和IP′-5相互作用的产率约为2.4%，实验结果表明，将五肽IP-5第2位氨基酸由侧链为氢原子的甘氨酸Gly替代疏水的苯丙氨酸Phe后，多肽结合的产率减小，肽-肽相互作用的结合强度变弱，表明疏水作用能增强多肽间的非共价作用。Ⅱ-5和IP″-5相互作用的产率约为2.9%，IP-5第3位氨基酸由甘氨酸Gly替代带羟基的苏氨酸Thr后，IP″-5与Ⅱ-5的氢键作用弱于IP-5与Ⅱ-5的氢键作用，Ⅱ-5和IP″-5非共价结合减弱，表明氢键能增强多肽间的非共价作用。以上实验结果表明，疏水作用和氢键在非共价作用中起着非常重要的作用，将疏水支链和带羟基的支链替换成氢原子后，多肽间相互作用明显减弱。

3 结论

在多肽相互作用中，利用ESI-MS能够研究多肽相互作用的强弱。结果表明，多肽中如果存在含有巯基侧链的氨基酸，则倾向于自身相互作用形成二硫键结合在一起，阻碍含巯基多肽与其他分子相互作用形成复合物。多肽中含有疏水侧链和羟基侧链会形成氢键和疏水作用，从而增强多肽间的非共价作用，对多肽间的相互作用影响很大；将疏水侧链和羟基侧链分别用H原子替代后，多肽间的相互作用明显减弱。利用ESI-MS能够快速分析生物分子间的作用力，定性判断它们之间的结合强度，通过改变多肽分子的结构，研究多肽分子间非共价作用的影响因素，为研究生物大分子高级结构和分子间的相互作用提供帮助。