LC-MS/MS分析结合优化提取工艺探究啤酒中麸质蛋白

2022-03-16于欣禾李明慧

质谱学报 2022年2期

于欣禾，李明慧，孙珍

(1.大连工业大学生物学院，辽宁大连 116034；2.华中师范大学化学学院，湖北武汉 430079)

麸质蛋白是小麦、大麦、黑麦和燕麦等早熟禾亚科谷物淀粉胚乳中的主要贮藏蛋白家族，占小麦总蛋白含量的70%～80%。根据麸质蛋白在醇溶液中溶解度的不同可分为2种组分[1]，一种是溶于醇类的富含脯氨酸(Pro)和谷氨酰胺(Gln)的醇溶蛋白，另一种是不溶于醇的组分，称为麦谷蛋白。许多不溶于醇的蛋白质在结构上与醇溶蛋白非常相似，据文献[2]报道，在还原剂存在的情况下，麦谷蛋白也可以被水溶性醇类提取。此外，硫氧还原蛋白的还原反应可以改变小麦淀粉胚乳蛋白质在谷物萌发和幼苗发育过程中的溶解度[3]。乳糜泻疾病被定义为一种慢性T细胞介导的肠道病，由遗传性易感个体食用麸质引起的，其患者约占全球人口的1%。乳糜泻疾病的临床症状因患者而异，既包括肠道症状，如腹泻或脂肪泻，也包括肠外症状，如骨痛或骨质疏松症[4]等。现阶段，虽然已经提出了几种治疗乳糜泻疾病的方法，如：酶法[5-6]、使用降解麸质蛋白的微生物[7]方法、使用工程改造过的谷物多肽和抑制性醇溶蛋白多肽[8]方法等，但对于乳糜泻疾病患者来说，唯一有效的治疗方法仍是终生坚持严格的无麸质饮食。根据欧盟委员会第1169/2011号条例规定：麸质蛋白含量低于20 mg/kg的产品可贴上“无麸质”标签，在20～100 mg/kg之间的产品可贴上“极低麸质”标签。

目前，几种典型的酶联免疫吸附试验法，如R5、Skerritt和G12抗体可用于麸质蛋白分析。其中，R5抗体与QQPFP、QQQFP、LQPFP和QLPFP序列结合最强[9-10]；Skerritt抗体能特异性识别高分子质量麦谷蛋白[11-12]；G12抗体是针对合成的33聚体毒性α2-醇溶蛋白，能够识别QPQLPY表位[13-14]。但使用酶联免疫吸附测定法会因为食品加工过程中蛋白发生的各种变化及试剂盒的估算方式，造成麸质蛋白含量的高估或低估[15-16]。此外，竞争型酶联免疫吸附测定法中使用的标准物质并不能完全代表在不同发酵过程中产生的所有麸质蛋白[17]。

在啤酒生产过程中，醇溶蛋白和其他储存蛋白可能在制麦过程中被活化的蛋白酶降解[18]。糖化过程中的高温也可能导致麸质蛋白改性，影响酶联免疫吸附测定法的检测结果。此外，谷氨酰胺(Q)残基存在于免疫原性表位的结合位点，使得表位容易发生脱酰胺反应。据文献[19]报道，对小麦有耐受性的受试者食用了含有去酰胺化麸质蛋白的食品后，出现了严重的过敏反应。可见，在评价乳糜泻疾病患者的食品安全性时，也应考虑去酰胺化的谷蛋白肽。质谱法具有高效、灵敏、微量分析等优点[20-21]，是解析啤酒蛋白质组学和肽组学的有力工具[22-24]，有研究使用质谱等手段检测发酵食品中水解麸质蛋白[25-26]。

本研究拟采用液相色谱-质谱联用法评价7种不同的麸质蛋白提取方法，通过优化提取工艺，检测啤酒样品中的去酰胺化麸质蛋白多肽和麸质蛋白碎片。希望通过对8种市售啤酒的麸质蛋白图谱进行探索，为啤酒样品中麸质蛋白的提取及检测提供方法参考。

1 实验部分

1.1 主要仪器与装置

Ultimate 3000 RSLC液相色谱仪：美国Dionex公司产品；Q Exactive组合型四极杆Orbitrap质谱仪：美国赛默飞公司产品，配有电喷雾离子源(ESI)及Proteome Discoverer数据处理系统；超纯水处理系统：美国Millipore公司产品；万分之一天平：北京丹佛仪器有限公司产品；酶标仪：瑞士TECAN公司产品；水浴锅：上海精宏实验设备有限公司产品；冷冻高速离心机：德国Eppendorf公司产品；医用离心机：湖南湘仪实验室仪器开发有限公司产品；pH计：上海仪电科学仪器股份有限公司产品。

1.2 主要试剂与样品

碘代乙酰胺、1,4-二硫苏糖醇、三氟乙酸、甲酸、用于消化的酶(胰蛋白酶和糜蛋白酶)：美国Sigma-Aldrich公司产品；异丙醇、乙腈、甲醇：均为质谱级，美国Fisher Scientific公司产品；OASIS HLB固相萃取柱：美国Waters公司产品；离心过滤装置(截留质量3K和10K)：美国Millipore公司产品；蛋白浓度测定试剂盒：碧云天生物科技公司产品；RIDASCREEN Gliadian (R5)试剂盒：德国R-Biopharm公司产品；其他试剂均为分析级。

8种啤酒分别为小麦王(S1)、凯尔特人(S2)、哈尔滨啤酒(S3)、青岛全麦白啤(S4)、莫尔巴赫啤酒(S5)、酿酒狗啤酒(S6)、黑狮新动啤酒(S7)和ORIGN啤酒(S8)，其详细信息列于附表1(请登录《质谱学报》网站http:∥www.jcmss.com.cn下载，以下同)。

1.3 蛋白质提取

啤酒样品超声脱气后，用3K超滤管在4 ℃下以6 140 r/min离心60 min浓缩20 mL啤酒样品，超滤管底部溶液为Mr<3K组分(F3)。对于一步提取法，上清液用4倍样品体积的55%异丙醇(V/V)和2% 1,4-二硫苏糖醇(w/V)的混合液漩涡振荡，在60 ℃孵育30 min后，用3K超滤管将溶液替换为相应的缓冲液(6 mol/L盐酸胍，50 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0)。对于两步提取法，在文献[20]的基础上，根据上层溶液在醇中的溶解度进行分级。首先，将5 mL蛋白溶液用预冷的0.1 mol/L醋酸铵甲醇溶液(溶液Ⅰ)稀释4倍，然后于-20 ℃孵育过夜，取出后在4 ℃下以8 680 r/min离心10 min，所得沉淀部分为醇不溶性组分(F1)；上清部分用3倍样品体积的冷丙酮(溶液Ⅱ)在-20 ℃下继续孵育4 h，丙酮溶液沉淀蛋白质并离心3次，所得沉淀为醇溶性组分(F2)。对于两步提取方案，分别用0.1 mol/L醋酸铵甲醇(M1)、0.1 mol/L 50%醋酸铵甲醇(M2)、50%异丙醇(M3)、80%异丙醇(M4)、60%乙醇(M5)和20%三氯乙酸丙酮(M6)作为溶液Ⅰ进行提取方法优化。一步提取法则采用“55%异丙醇+2%1,4-二硫苏糖醇”(M7)溶液，按照Colgrave等[27]方法提取啤酒中的麸质蛋白。

1.4 蛋白质消化

将醇不溶性蛋白和醇溶性蛋白溶解于含有6 mol/L盐酸胍的50 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)中，用蛋白浓度测定试剂盒法测定各组分的蛋白浓度。样品于4 ℃保存。

采用文献[28]方法，使用3K超滤管消化每个蛋白质样品，消化的蛋白量约500 μg。简而言之，样品用10 mmol/L 1,4-二硫苏糖醇还原后，以14 420 r/min离心20 min去除缓冲液和多余的1,4-二硫苏糖醇，然后将样品放在用Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)配制的20 mmol/L碘代乙酰胺中，室温避光孵育40 min。烷基化反应后，用10 mmol/L碳酸氢铵溶液洗涤3次，以14 420 r/min离心20 min。最后，在10 mmol/L碳酸氢铵中加入胰蛋白酶和糜蛋白酶的混合酶，使酶与蛋白质的质量比为1∶30。在37 ℃孵育过夜后，以14 420 r/min离心20 min，收集洗脱的肽段进行LC-MS分析。对于Mr<3K组分，即未消化的多肽样品直接用OASIS HLB柱脱盐，用80%乙腈-0.1%三氟乙酸洗脱。洗脱液冷冻干燥后，用0.1%甲酸复溶。

1.5 实验条件

1.5.1色谱条件预柱：C18 PepMap100(100 μm×2 cm×5 μm)；色谱柱：国产C18毛细管分析柱(自制，75 μm×12 cm×3 μm，填料为Dr. Masch GmbH公司生产的C18)；流速0.3 μL/min；流动相：A相为0.1%甲酸水溶液，B相为0.1%甲酸-80%乙腈水溶液；梯度洗脱：0～3 min(4%～10%B)，3～25 min(10%～35%B)，25～31 min(35%～55%B)，31～32 min(55%～95%B)，32～42 min(95%B)，42～43 min(95%～4%B)。

1.5.2质谱条件电喷雾离子源(ESI)；正离子扫描方式；标准化碰撞能量27%；电喷雾电压2 300 V；毛细管加热温度275 ℃；完整多肽和碎片离子的分辨率分别为70 000和17 500；一级质谱质量扫描范围m/z350～1 800；选择最强的20个离子进行二级质谱扫描，自动增益控制(AGC)目标为3×106。

1.5.3数据分析使用Proteome Discoverer(2.2.0.388)以SEQUEST HT为搜索引擎处理质谱数据。数据库包含：大麦，214 798个序列；小麦，214 165个序列。肽鉴定的误检率控制在1%以下。对于酶解后的肽段部分(F1、F2组分)，胰蛋白酶和糜蛋白酶被指定为切割的酶，最多允许2个漏切位点。肽段的切割位点必须完全符合指定蛋白酶的切割特异性。对于Mr<3K的部分没有指定蛋白酶，因为在啤酒生产过程中，高温及自身水解等因素会使部分蛋白降解为肽段，而具体的切割特异性无从知晓，需要用非特异性的搜索方式考虑这部分。母离子允许的最大质量误差为1×10-5，碎裂离子允许的最大质量误差为0.02 u。最小多肽长度设置为6个残基，最大多肽长度设置为144个残基。半胱氨酸上的脲基甲基(+57.021 u)为静态修饰，蛋氨酸氧化(+15.995 u)、蛋白N-端乙酰化(+42.011 u)和脱酰胺化(+0.984 u)设置为动态修饰。

1.6 酶联免疫吸附测定法

采用RIDASCREEN Gliadin(R5)夹心型酶联免疫吸附测定试剂盒检测啤酒中麸质蛋白。按生产厂家提供的说明书进行醇溶蛋白的提取和测定。酶联免疫吸附测定法微量滴定板中的每个样本均重复2次，每个孔的光密度(吸光度)用TECAN Infinite F50微板阅读器(瑞士)在450 nm处测定，使用RIDA SOFT WIN(R-Biopharm，德国)软件分析3次样条曲线数据。

2 结果与讨论

2.1 LC-MS/MS分析评价啤酒麸质蛋白提取方法的优化

本实验比较了M1～M6作为醇溶性蛋白提取液及一步分级法采用的M7溶液对啤酒中麸质蛋白提取的效果，结果列于表1。可见，M3对醇不溶蛋白部分的麸质蛋白鉴定率最高，鉴定了157个；而M1对醇溶蛋白部分的麸质蛋白鉴定率最高，鉴定了179个；总体而言，M1鉴定到225个麸质蛋白，是7种方法中最高的。因此，本实验选择M1作为提取液。可以看出，在提取方案M1～M5中，醇不溶性组分和醇溶组分的鉴别有小部分重叠，主要原因可能是有些蛋白质既不极易溶于醇，也不完全不溶于醇。此外，还可能是还原剂的存在(比如硫氧还原蛋白的还原反应)改变了蛋白质在醇中的溶解度[3]。

表1 7种不同麸质蛋白提取法对醇不溶性和醇溶性麸质蛋白的鉴定结果Table 1 Results of gluten proteins identified in alcohol-insoluble fraction and alcohol-soluble fraction using seven different gluten extraction protocols

本实验选取能够被多种蛋白提取方法同时鉴定的5个蛋白，比较不同提取方法的蛋白质覆盖率和检测到的多肽数量，结果列于表2。以1种蛋白质(UniProt ID：Q94IJ6)为例，除了M6和M7外，该蛋白质能够通过5种提取方法(M1～M5)鉴定。可以看出，M1鉴定了蛋白质覆盖率最高为38%的蛋白质序列，同时鉴定出24个多肽，它们属于Q94IJ6。同样的情况发生在蛋白质Q8W3W8、A5JSA3和A0A159KI54上。对于蛋白质D2KFH1，使用M1鉴定到的蛋白质覆盖率略低于M6，但两者识别的多肽数量相同，可能是由鉴定的多肽长度不同导致的。根据附表2中的结果可以看出，M7和M1鉴定的蛋白平均覆盖率较高，但考虑到M1鉴定的麸质蛋白总数比M7多24%，综合考虑仍然选择M1作为优化的提取方法。

表2 所选5种麸质蛋白的蛋白质覆盖率和鉴定肽数Table 2 Protein coverage and the number of identified peptides of five selected gluten proteins

2.2 提取方法的重复性

本研究考察了M1提取法的重复性。在3个批次实验中，从同一瓶啤酒中提取20 mL等量啤酒样品，分别鉴定出225、221和224种麸质蛋白。3批实验均鉴定出的麸质蛋白数为141种，占每次鉴定数量的43%以上。同时，在2批以上实验中共鉴定出205种相同麸质蛋白，占总鉴定数目的63%以上。对这3批实验共同鉴定到的141种蛋白提取相应的定量结果，用Origin软件进行皮尔斯相关系数计算，结果示于图1。可以看出，相关系数均在0.9以上，表明M1提取方法的定量重复性较好。

图1 重复实验中相对定量丰度的相关系数图Fig.1 Correlation coefficient diagram of relative quantitative abundance in repeated experiments

2.3 LC-MS/MS鉴定啤酒中麸质蛋白碎片和去酰胺化麸质蛋白多肽

本实验对麸质蛋白碎片研究的主要目的是研究啤酒样品的肽组分。考虑到啤酒中多肽在生产过程中存在自然水解，因此没有指定酶特异性，最大限度地获取水解肽信息。从分离的多肽组分(F3)中鉴定出430个肽序列，其中111个肽归属于37个麸质蛋白片段，列于附表3，在该组分中能够检测到不同程度的麸质蛋白水解。例如，VRVPVPQLQPQNPSQQQPQ和VPVPQLQPQNPSQQQPQ是从同一麸质蛋白多肽中水解而来的；IIQPQQPAQLEAIR、IIQPQQPAQLEAIRSL和IQPQQPAQLEAIR是从同一麸质蛋白多肽中衍生出来的。通过对含有抗体能识别表位的谷蛋白多肽进行分析，在F3中检测到47个含有免疫原性表位的谷蛋白多肽，这些表位来源于24个麸质蛋白片段，列于附表4。例如，QPQPVQPQQP是在PQQP[29]的扩展氨基酸基序中检测到的多肽，而在多肽列表中也检测到具有受损表位的QPQPVQPQQ。这验证了在啤酒生产过程中，酶联免疫吸附试验检测麸质蛋白的表位会被破坏，从而影响检测的准确性。

表3 8种啤酒的每个组分(F1、F2、F3)中确定的麸质蛋白或麸质蛋白片段的数量Table 3 Number of gluten proteins or gluten fragments identified in each fraction (F1, F2, F3) of eight types of beer

谷氨酰胺(Q)残基含量高，不仅谷氨酰胺表位容易受损，而且谷氨酰胺容易发生去酰胺化。谷氨酰胺转化为谷氨酸会影响抗体与抗原的相互作用，从而限制抗体的识别能力，但是去酰胺化的麸质蛋白仍然可能引起过敏反应。通过对麸质蛋白多肽的脱酰胺化进行研究，可以看出，脱酰胺化在3个组分的鉴定中是普遍存在的。尽管样品制备的步骤(包括变性、还原、烷基化和酶消化)可能直接影响谷氨酰胺(Gln)脱酰胺化检测的总水平，但Gln的脱酰胺化速度比天冬酰胺(Asn)慢很多，这是因为六元戊二酰胺环的形成速度比五元琥珀酰亚胺环的形成速度慢[30]。在利用蛋白质组学技术分析样品过程中发现，4%～9%多肽发生了一定程度的非酶促天冬酰胺脱酰胺反应[31]，推测谷氨酰胺的自发脱酰胺化在谷氨酰胺脱酰胺化检测总水平中所占的比例要小得多。因此，本实验没有区分样品制备前或过程中发生的谷氨酰胺脱酰胺化。通过将谷氨酰胺的脱酰胺化(+0.984 u)作为动态修饰，在F1和F2组分中分别测定了430和573个脱酰胺的肽段，列于附表5、6，F3中还检测到52个脱酰胺的肽段，列于附表7。例如，检测到表位为QQLFP(加粗字体显示)的QPQQLFPQQPQQPLPQPQQPF在Q4残基上发生脱酰胺化，而Q4就是表位的Q残基。QPFPQPQLPYPQPHLPYPQPQPF的QPQLPY被确定是在Q7残基上去酰胺化。此外，许多含有免疫原性表位的谷蛋白多肽也存在脱酰胺化反应，但没有准确的定位。因此，本方法可作为酶联免疫吸附试验结果的补充方法，用于脱酰胺化麸质蛋白的多肽以及麸质蛋白碎片的检测。

2.4 LC-MS/MS分析8种啤酒中麸质蛋白图谱

在啤酒生产过程中，麸质蛋白被降解为可溶性多肽和游离氨基酸。因此，完整麸质蛋白和麸质蛋白降解肽都应该考虑在内。本实验使用3K超滤管从多肽中分离出可能完整或轻微降解的麸质蛋白，用优化的提取方案对过滤上清液进行进一步处理，将麸质蛋白浓缩成2个组分(醇不溶性组分F1和醇溶性组分F2)，最后，将富集组分(F1、F2)和分离得到的多肽组分(F3)进行液相色谱-质谱分析，其流程示于图2。

注：T+C表示胰蛋白酶和糜蛋白酶的混合酶液图2 LC-MS/MS结合优化提取条件鉴定8种啤酒中麸质蛋白的过程Fig.2 Outline of the strategy of identification of gluten in eight types of beer using LC-MS/MS combined with optimized extraction protocol

本实验在8种啤酒的3种组分中均鉴定出麸质蛋白，示于图3。可以看出，由于谷物成分和酿造技术的不同，啤酒之间存在显著的差异。以啤酒样品S4为例，从F1、F2中共鉴定出225个麸质蛋白，F3中共检测到36个麸质蛋白，重叠部分(6个麸质蛋白)仅占麸质蛋白鉴定总数(255个麸质蛋白)的2.3%。因此，结合蛋白质组分和肽组分可以显著提高麸质蛋白的鉴定能力，结果列于表3。从啤酒样品S4中鉴定的麸质蛋白分布来看，小麦含量最高(51%)，其次是小麦麦谷(33%)、大麦(7%)、黑麦(6%)、类燕麦(3%)。根据麸质蛋白分类，可以推断啤酒酿造原料应含有大麦和小麦，小麦所占比例可能大于大麦。由于麦芽中黑麦和类燕麦的含量较低，它们可能是麦芽中的杂质，或是同源鉴定的结果[32]。

图3 8种啤酒中麸质蛋白的分布Fig.3 Distribution of gluten proteins identified in eight types of beer

用RIDASCREEN Gliadin(R5)夹心型酶联免疫吸附测定试剂盒对这8种啤酒进行鉴定。根据3次样条曲线，计算出S2、S3、S4和S5的麸质蛋白含量均在270 mg/kg以上；S1的麸质蛋白含量为108.69 mg/kg，明显高于20 mg/kg；S6、S7和S8的麸质蛋白含量分别为15.81、19.75和10.77 mg/kg；S6和S8的麸质蛋白含量均小于20 mg/kg，这与S6和S8是无麸质啤酒的事实一致；而以大麦为主要原料发酵的S7麸质蛋白含量也低于20 mg/kg，这显然是不真实的。由此可见，S7的酶联免疫吸附试验结果并不能真实地反映麸质蛋白含量。

在S6和S8的3种组分中鉴定出的麸质蛋白总数分别为26个和37个，是8种啤酒中最少的，与酶联免疫吸附测定法结果一致。然而，经过整个发酵过程，一些麸质蛋白以及麸质蛋白相关肽段仍然可能保留在啤酒中。Watson等[33]用夹心型(R7001)和竞争型(R7021)RIDASCREEN Gliadin R5酶联免疫吸附测定法分析51款比利时大麦麦芽啤酒，定量分析麸质蛋白和多肽，发现大多数啤酒含有较低含量的麸质蛋白，只有少数啤酒是真正不含麸质蛋白(即含量≤20 mg/kg)。因此，为保证无麸质啤酒的安全性，麸质蛋白浓度和麸质蛋白对应肽段浓度均应控制在20 mg/kg以下。对于麸质含量远高于20 mg/kg的S1、S2、S3、S4和S5啤酒，可用质谱法检测出多种类型的麸质蛋白和麸质蛋白碎片。因此，质谱法可作为酶联免疫吸附测定法的补充来确认无麸质啤酒的食品安全性。