电针百会、神庭调控BNIP3L介导的线粒体自噬和减轻脑缺血再灌注损伤的机制研究

钟晓勇，李 成，王 芳，陈 斌，梁 晖，阮 甦

福建中医药大学附属人民医院，福建 福州 350004

脑卒中是目前国内外引起死亡的首要因素［1］。卒中后往往会引发持续性的神经功能障碍，已经成为影响国人健康和生活质量的重要疾病，也为社会造成巨大的经济负担。然而，目前卒中的临床治疗手段仍非常有限［2］。针刺是临床治疗缺血性卒中的有效补充手段，在急性期、恢复期、后遗症及康复期均有显著效果［3-4］。本课题前期研究表明，电针百会、神庭具有抗凋亡、抗氧化、促进生存因子表达等生物学作用，可以多通路、多靶点改善脑卒中模型大鼠的神经功能及认知功能障碍［5-9］，但其具体作用机制仍需进一步阐明。

近期线粒体自噬在缺血性卒中后的神经保护作用机制受到越来越多关注。线粒体自噬作为一种选择性自噬，在清除受损线粒体、保护受损神经细胞方面起着重要的作用。研究表明，脑缺血再灌注过程可激活线粒体自噬，清除损伤的线粒体，进而减少线粒体依赖的细胞凋亡［10-11］。此外，通过进一步促进线粒体自噬可减轻缺血引起的神经损伤［12］，被认为是治疗缺血性卒中的新靶点。近期WU 等［13］研究表明，逆转BNIP3L 降解促进线粒体自噬在缺血性脑损伤中发挥着重要的神经保护作用。已有研究表明电针可通过调节自噬对脑缺血再灌注大鼠产生神经保护作用［14-16］，但目前尚未有线粒体自噬相关的作用机制研究。因此，本研究拟从电针调控BNIP3L 介导的线粒体自噬、减轻脑缺血再灌注损伤和细胞凋亡为研究切入点，为电针改善卒中后神经功能障碍的作用机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 动物及分组造模

1.1.1 动物 选择SPF 级雄性sprague-dawley（SD）大鼠60 只，体质量（300±20）g，由上海斯莱克实验动物责任有限公司提供［生产许可证号：SCXK（沪）2017-0005］，恒温恒湿，12 h 明暗光照交替，昼夜循环，饲养于福建中医药大学动物实验中心。福建中医药大学动物实验中心动物饲养环境许可证：SYXK（闽）2019-0007。

1.1.2 分组与造模 采用随机数字表法将60 只大鼠随机分为假手术组15只和手术组45只。所有大鼠术前禁食12 h 后，采用线栓法制备大鼠大脑中动脉线栓阻塞法（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型。具体方法参考Zea Longa 方法［17］：应用10%水合氯醛按0.35 g/kg 腹腔注射麻醉大鼠，麻醉后固定于定位仪上，切开右侧颈部皮肤，分离并在根部结扎颈外动脉，从右侧颈总动脉分叉下方约3～4 mm处剪一“V”形小口，将3 cm尼龙线插入，当有阻力时停止插入，此时尼龙线进入颈内动脉约为18 mm，待缺血90 min 后拔出线栓再灌注，固定尼龙线并缝合皮肤。成功后2 h采用Zea Longa法［17］进行神经功能缺损评分。评分标准：0 分，无神经损伤症状；1 分，不能完全伸展对侧前爪；2 分，外侧（右）转圈；3 分，向对侧倾倒；4 分，不能自发行走，意识丧失，分值越高，损伤越严重。将1～3 分的大鼠纳入正式实验，0 分和4 分均认为模型不成功。假手术组将正常SD大鼠，麻醉后固定于定位仪上，切开右侧颈部皮肤，只分离、暴露血管，不结扎，不插入尼龙线，缝合皮肤。手术组造模成功率约为70%，本次实验共30 只大鼠造模成功，考虑均衡原则，进一步将造模成功手术组大鼠随机分为模型组、电针组和电针＋3-MA 组，每组10 只。动物处理方法按照中华人民共和国科技部颁发的《关于善待实验动物的指导性意见》执行，并经福建中医药大学医学伦理委员会审定。

1.2 主要器材和试剂

LC3B、BNIP3L、SQSTM1、β-actin抗体（美国Cell Signaling Technology 公司）；TUNEL 试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）；三甲基腺嘌呤（3-MA）（美国Sigma 公司），Pannoramic 扫描仪（匈牙利，3Dhistech）；华佗牌电针仪（SDZ-Ⅱ，苏州医疗用品厂有限公司）；Gel DOC 2000 凝胶成像系统、APC 300电泳仪、水平电泳槽（美国BioRad公司）。

1.3 干预方法

①假手术组：饲养于普通笼中，只同等条件抓取，无电针刺激。②模型组：造模后饲养于普通笼，只同等条件抓取，无电针刺激。③电针组：电针大鼠百会、神庭，参照《实验针灸学》［18］及华兴邦制定的实验动物穴位图谱［19］。用华佗牌0.3 mm×13 mm毫针，30°斜刺入0.2 cm，随后用华佗牌电针仪（SDZ-Ⅱ）通电干预。设置波形模式为疏密波，其中疏波4 Hz，密波20 Hz，输出电压2 V，输出电流0.5 mA，以针体轻轻抖动为判断电针得气标准。电针干预于造模后24 h开始，每次治疗时间为20 min，每天同一时间治疗1 次，连续7 d。④电针＋3-MA组：在复灌注开始时，大鼠侧脑室注射7.5 μg 3-MA，3-MA 在生理盐水中加热药液至60～70 ℃充分溶解，降至常温后注射（参考WEN 等［20］的方法），连续7 d。电针干预方法及治疗参数同电针组。

1.4 取材及指标检测

1.4.1 取材 干预7 d 后取材，各组大鼠在1%戊巴比妥的麻醉下行开颅，大脑组织取出后迅速置于-80 ℃冰箱保存或固定后制成石蜡标本保存，用于后续指标检测。

1.4.2 神经功能评分 造模后第1天、第3天、第5天、第7 天再次采用Zea Longa 法进行神经功能评分（具体步骤详见上述），评估神经功能改善情况。

1.4.3 HE 染色 取各组大鼠梗死区域脑组织及梗死侧海马组织固定于10%福尔马林中4～6 h，石蜡包埋，连续切片，厚4 μm，常规苏木素伊红（HE）染色，光镜下观察各组病理形态学改变。

1.4.4 Western blot 检测LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表达水平 取50 μg 左侧大脑皮质区脑组织，加入RIPA裂解液超声下充分裂解后，采用Bradford 法蛋白质定量，用15%聚丙烯酰胺凝胶电泳，考马斯亮蓝染色标记蛋白质分子量标准，然后转移至PVDF 膜上，于封闭液中进行封闭，经封闭洗涤后加入相应的单抗，4 ℃过夜孵育，洗涤，然后分别与生物素标记的IgG、辣根过氧化物酶标记的链霉素卵白素工作液（S-A/HRP）常温孵育，DAB 显色液显色，蒸馏水清洗终止反应，图像扫描。目的蛋白的表达量用内参校正后的各组蛋白的灰度值与假手术组蛋白的灰度值比较。

1.4.5 组织免疫荧光检测 将石蜡组织切片后，脱蜡，梯度脱水，滴加封闭血清，在湿盒中37 ℃封闭30 min。滴加第1 种一抗（BNIP3L）置湿盒中4 ℃孵育过夜，再用PBS 3 min×5次洗去一抗，用滤纸擦去标本外的PBS。滴加对应的HRP 标记二抗室温置湿盒中避光孵育1 h，PBS 3 min×3 次洗去二抗，再加入CY3-TSA 孵育10 min。微波抗原修复后加入第2种一抗（SQSTM1），按上述步骤加入HRP和FICTTSA。最后滴加DAPI 避光孵育2 min 复染细胞核。用PBS 1 min×3次洗去DAPI，用滤纸擦去标本外的PBS。最后用含甘油封片，并在荧光显微镜下立即观察。

1.4.6 电针对各组大鼠凋亡率的影响 将石蜡包埋的脑组织切片后，按常规方法进行脱蜡及水化，PBS漂洗2 次，加入蛋白酶K 工作液，37 ℃孵育30 min，随后依次加入TdT 酶反应液、HRP 工作液、DAB 工作液进行标记和显色反应。

1.5 统计学方法

采用SPSS 25.0 统计软件处理数据。计量资料符合正态分布的以（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析检验，组间两两比较采用LSD-t检验。方差不齐的情况下用Tamhane'sT2方法进行事后检验。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 电针对MCAO模型大鼠的神经功能改善作用

造模2 h 后Zea Longa 法进行神经功能缺损评分。图1 可见造模2 h 后手术组大鼠神经功能评分均显著升高，评分均在1～3 分之间，提示手术造模成功。假手术组大鼠未表现出神经功能缺损症状，评分均为0。造模干预后第1 天、第3 天、第5 天、第7 天再次进行神经功能评分。在第7 天模型组及电针＋3-MA 组大鼠神经功能评分仍显著升高，与假手术组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。而电针组大鼠在电针干预后神经功能评分显著降低，与模型组及电针＋3-MA 组比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。

图1 4组大鼠神经功能评分比较Figure 1 Comparison of neurological function scores in four groups

2.2 电针对MCAO 模型大鼠脑皮质区病理形态的影响

假手术组可见神经元胞体较大，多角形（多个突起），核着色浅，胞质可见特征性结构尼氏体；模型组神经元皱缩，胞质结构不清，胞浆嗜依红染色增强，尼氏体边聚或消失，核固缩，有的胞体变形缩小，呈三角形，细胞周围间隙增宽；电针组可以在一定程度上减轻缺血再灌注所致的病理损伤，而电针＋3-MA组则会阻断电针的治疗作用。见图2。

图2 4组大鼠脑皮质区HE染色结果（×100）Figure 2 HE staining results of cerebral cortex of rats in four groups(×100)

2.3 电针对MCAO 模型大鼠皮层组织中自噬水平的影响

我们进一步采用LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ检测了4 组大鼠皮质中自噬激活水平，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ增加代表自噬激活。Western blot 结果表明，模型组大鼠LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ水平降低，与假手术组比较差异有统计学意义（P＜0.05）；电针组的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ水平显著升高，与模型组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。电针＋3-MA 组中使用自噬抑制剂3-MA 可以逆转电针对LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表达上调作用，且与电针组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图3。

图3 电针对MCAO模型大鼠皮层组织中自噬水平的影响Figure 3 Effects of electroacupuncture on autophagy level in cortical tissue of MCAO model rats

2.4 电针对4 组大鼠皮质区线粒体自噬水平的影响

线粒体自噬相关蛋白BNIP3L 和SQSTM1 表达和共定位的结果表明，模型组中皮质梗死区域线粒体自噬水平缺失，表现为红色荧光和绿色荧光强度弱；电针干预可以激活梗死区域神经细胞的线粒体自噬，表现为红色荧光和绿色荧光的表达增高及共定位增强（橘黄色）；应用3-MA 抑制剂干预后，电针干预对上述线粒体自噬激活的作用被逆转。见图4。

图4 电针对MCAO 模型大鼠皮层组织中线粒体自噬水平的影响（×400）Figure 4 Effects of electroacupuncture on mitophagy level in cortical tissue of MCAO model rats(×400)

2.5 电针对4组大鼠皮质区细胞凋亡率的影响

采用TUNEL 法检测了各组大鼠皮质中细胞凋亡水平，模型组大鼠凋亡率升高，与假手术组比较差异有统计学意义（P＜0.05）；而电针组的凋亡率降低，与模型组比较差异有统计学意义（P＜0.05）；电针＋3-MA 组中使用自噬抑制剂3-MA 可以逆转电针降低凋亡水平的作用，且与电针组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。见图5。

图5 电针对4组大鼠皮质区细胞凋亡率的影响（×400）Figure 4 Effect of electroacupuncture on apoptosis index of cortical region of rats in four groups(×400)

3 讨 论

脑缺血再灌注损伤是一个复杂的病理生理级联反应过程，包括神经细胞内钙离子超载、脂质过氧化、氧自由基损伤、凋亡基因激活、炎性细胞因子损害等［21］。线粒体作为细胞能量代谢的中心，在这些病理反应进程中起着核心作用。线粒体功能障碍在缺血性脑中风中已被证实是神经元死亡的原因之一［22］。研究表明激活线粒体自噬可以及时清除脑缺血再灌注损伤模型大鼠神经细胞中损伤的线粒体，减少线粒体依赖的细胞凋亡［10-11］。因此通过调控线粒体自噬对治疗缺血性卒中具有重要的意义。其中BNIP3L 作为一类线粒体自噬受体蛋白，在细胞发育或病理条件下，可以通过与自噬泡相关蛋白LC3 结合促进线粒体自噬，在调控线粒体自噬中发挥着重要的作用［23］。研究发现BNIP3L 基因敲除可以显著抑制脑缺血再灌注诱导的线粒体自噬，并且加重缺血性脑损伤［11］。近期研究表明，通过逆转BNIP3L 降解促进线粒体自噬在缺血性脑损伤中发挥着重要的神经保护作用［13］。这些结果提示通过调控BNIP3L 介导的线粒体自噬并且抑制神经细胞凋亡是潜在的脑卒中治疗干预靶点。前期实验研究已证实针刺百会、神庭可以多通路、多靶点减轻MCAO 模型大鼠卒中后脑缺血损伤［9，24］，其机制可能与减轻线粒体损伤、保护受损神经细胞相关［25］。此外有研究表明电针百会、神庭也可以通过调控自噬达到保护神经细胞的功能［26-27］。但目前尚未有从调控线粒体自噬及细胞凋亡角度开展相关作用机制研究。因此，本研究以电针调控BNIP3L介导的线粒体自噬和凋亡为研究切入点，初步阐明电针减轻脑缺血再灌注损伤以及改善卒中后神经功能障碍的作用机制。

本研究结果表明，MCAO 模型大鼠7 d后皮层组织中自噬水平较假手术组显著降低，表现为LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白水平降低，提示手术组大鼠MCAO再灌注7 d 后由于皮层神经细胞自噬水平的缺失，导致大鼠清除受损神经细胞的能力下降。这与李建荣等［28］研究相似，该研究表明大鼠MCAO 造模后皮层自噬水平呈动态变化，在7 d 左右自噬水平下降。而电针组电针干预治疗可以在一定程度上激活自噬，表现为电针组的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表达水平显著升高。这提示电针可以通过激活自噬，提高神经细胞自我清除和保护能力。徐疏影等［14］研究结果亦提示电针可以通过激活自噬产生保护作用。为进一步阐明电针激活自噬保护受损神经细胞的机制，本研究观察了电针百会、神庭对一类选择性自噬——线粒体自噬及相关调控蛋白BNIP3L表达的影响。研究结果表明电针可以提高线粒体自噬相关蛋白BNIP3L 和SQSTM1 的表达及共定位，表现为组织免疫荧光检测中电针组大鼠皮质组织中红色荧光和绿色荧光的表达增高及共定位增强（橘黄色）。SQSTM1 是一种重要的选择性自噬接头蛋白，也是监测自噬水平的重要自噬标志蛋白，其表达增高和线粒体自噬受体蛋白BNIP3L 共定位增强提示线粒体自噬水平提高。该结果提示电针激活自噬产生神经保护作用的机制和其激活线粒体自噬相关，通过激活线粒体自噬，清除受损线粒体，进而减轻线粒体依赖的细胞凋亡，从而达到改善神经功能评分和病理改变的目的。TUNEL 检测结果、神经行为学评分以及病理学结果均很好地证实了这一点。为验证电针对线粒体自噬的激活作用以及神经保护作用，我们在电针＋3-MA 组中使用自噬抑制剂3-MA 进行反向验证，结果表明3-MA 可以逆转上述电针对线粒体自噬的激活和抗凋亡作用，进一步验证了电针的作用靶点。

综上，本研究表明电针可以通过调控BNIP3L介导的线粒体自噬减轻脑缺血再灌注损伤和细胞凋亡，从而达到改善神经功能预后的作用。但自噬途径多样，电针能否通过调控其他自噬相关通路产生神经保护作用，其具体作用机制仍需进一步阐明。