地黄梓醇对中风后抑郁大鼠行为学影响及机制研究

2022-03-16王祥煜刘付红张佳乐孙立平李万斌

康复学报 2022年1期

王祥煜，周霞，刘炬，刘付红，张佳乐，孙立平，李万斌

1 山东中医药大学，山东济南 250014；

2 山东中医药大学第二附属医院，山东济南 250001；

3 山东第一医科大学第一附属医院，山东济南 250014

中风后抑郁，又称卒中后抑郁（post-stroke de⁃pression，PSD），是中风常见的并发症，指继发于中风病的以兴趣减退、情绪低落、自罪自责等情感障碍为主要临床表现的综合征［1］。一项针对中风患者的回顾性研究表明，PSD 病患死亡率是非PSD 患者的3～4 倍［2］。有研究表明，其发生与5-羟色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）、去甲肾上腺素（norepineph⁃rine，NE）和脑源性神经营养因子（brain-derived neu⁃rotrophic factor，BDNF）含量的降低有关［3-4］。当单胺类神经递质与神经营养因子功能紊乱，尤其是情志调控的脑部区块如海马含量下降时，可能造成抑郁现象。生地黄是历代医家治疗中风病的常用组方用药之品，梓醇是其主要有效成分。本项目组在前期研究已证实梓醇具有促血管新生效应，调控血管内皮生长因子及其受体是其作用机制之一［5］。中风后抑郁是抑郁症的特别类型，其形成原因复杂，如中枢神经器质性损伤导致的功能障碍、情志调控脑区的损伤、家庭与社会支持系统薄弱等。由于其系中风病的并发症之一，中枢神经器质性病变及因中风导致的各种功能障碍造成的“无力、无望、无助”感是其内在根本原因，社会家庭支持及个人信念系统是其外部原因。因此通过改善中枢神经系统功能及对特定脑区神经内分泌状态调控可帮助中风患者尽可能恢复缺损神经功能，改善心理情绪状态，而二者又可以相互影响，相互促进，从而帮助中风患者重建生活信心与自理能力，回归家庭和社会。除康复训练外，具有神经血管单元保护、促进神经功能重塑且具心理情绪相关神经内分泌调控能力的药物或组分是治疗本病的理想目标。基于此，本研究通过观察地黄梓醇干预后中风后抑郁大鼠行为学变化，并从脑组织形态学、中枢及外周血清5-HT、NE、BDNF 的影响，探讨其作用机制，为临床治疗提供参考。

1 资料与方法

1.1 研究对象

SPF 级雄性SD 大鼠24 只，体质量（220±20）g，购自济南朋悦实验动物繁育有限公司［SCXK（鲁）2019-0003］。动物适应环境：温度21～25 ℃，日温差±1 ℃，湿度50%～70%，普通饲料喂养。

1.2 实验药物

梓醇纯度≥98%，相对分子质量为362.33（上海源叶科技有限公司）。

1.3 试剂与仪器

MCAO 线栓（北京西浓科技有限公司），水合氯醛（阿拉丁C104202-500 g）；ELISA试剂盒（美国R&D公司）；XR-XZ301 型旷场试验箱、XR-XG201 型高架十字迷宫（上海欣软信息科技有限公司）；SMART 2.5视频行为学分析系统（西班牙Panlab 公司）；2，3，5-Triphenyltetrazolium chloride（TTC，Sigma 公司，T8877-25G）。

1.4 分组与干预处理

SD 大鼠24 只，采用随机数字表法分为模型组、梓醇干预组和假手术组，每组8 只。除假手术组以外，其余2 组大鼠以大脑中动脉线栓阻塞法（middle cerebral artery occlusion，MCAO）［6］联合慢性不可预见性温和应激法（chronic unpredictable mild stress，CUMS）［7］诱导抑郁样行为建立PSD大鼠模型。①具体操作方法：术前12 h 禁食，10%水合氯醛（0.4 mL/100 g）腹腔注射麻醉后，将其用医用胶带仰卧位固定于操作台上，颈部备皮，酒精棉球消毒。沿大鼠锁骨正中做竖向切口，在手术显微镜下暴露右侧并钝性剥离出颈总动脉（common carotid artery，CCA）、颈外动脉（external carotid artery，ECA）和颈内动脉（internal carotid artery，ICA）。结扎右侧CCA 与ECA的远心端，使用止血夹夹闭ICA。在距离CCA 分叉3 mm 处的CCA 上用眼科剪剪出一个长约0.3 mm 的小口，插入线栓，进入ICA，并向内深入大脑中动脉。栓线插入完毕后，将预留的结扎线拉紧固定，清理颈部血块，逐层缝合皮肤。整个试验过程中大鼠置于37 ℃恒温台，注意保暖，待大鼠恢复清醒后放于饲养箱，保持恒温、恒湿。在手术过程中死亡或处死解剖后发现脑出血者剔除，重新选取大鼠造模，补充到相应组中，保证每组动物数量。②造模成功标准：大鼠苏醒后出现左侧前肢弯曲、肩内旋和以对侧上肢为重的瘫痪，前进时向手术对侧转圈。选用缺血造模成功的大鼠，手术后第1 天开始每天不同时间选取夹尾1 min、禁水24 h、禁食24 h、束缚5 min、昼夜颠倒24 h、电击1 min、4 ℃冰水游泳5 min 等7 种刺激方法中的1种，交替应激大鼠，避免大鼠产生耐受性，共刺激7 d。假手术组仅剥离出CCA、ICA 和ECA，不插入线栓，不给予CUMS 刺激。通过旷场试验评价造模是否成功。

1.5 药物干预

梓醇干预组给予地黄梓醇9 mg/kg，使用生理盐水配制［8］。模型组给予等体积生理盐水。假手术组不给予任何药物干预。于造模成功后24 h 内经腹腔注射给药，每日1次，连续7 d。

1.6 行为学观察

1.6.1 旷场试验于造模后第1天、第4天、第7天测评。采用立柱体旷场试验箱，底边长和宽各100 cm，高40 cm，周壁内面及底面均染为黑色。将大鼠放在试验箱底中心，使用SMART2.5 实时视频行为学分析系统观察大鼠3 min 内运动情况。试验布置在暗室内，每次测定结束将大鼠尿液及粪便用酒精清理干净并用干布擦干，再进行下1 只大鼠的观察。统计大鼠旷场方格穿越格数、站立次数、移动总距离，以评估运动能力。

1.6.2 高架十字迷宫测定于造模后第1天、第4天、第7天测评。试验开始前将每只大鼠置于塑料盒子中令其适应环境5 min。任由大鼠自由探索5 min后快速放在高架十字迷宫的正中心区域，令头部正对随机1个开放臂，释放后对进入开放臂的次数（OE）、进入开放臂的时间（OT）、进入封闭臂的次数（CE）、进入封闭臂的时间（CT）4 个指标进行测定。根据OE、OT、CE、CT 计算进入开放臂次数的比例（OE%）与进入开放臂时间的比例（OT%）。每只测定5 min。每次测试后，使用酒精清洁高架十字迷宫粪便、尿液等杂质残留以及去除异味，并用干布擦干。

1.7 ELISA法检测血清5-HT、NE、BDNF含量

于造模后第1 天、第4 天、第7 天早晨采集大鼠尾静脉血，标本置于抗凝塑料管内，混合离心后取血浆2 mL 于空白管内，低温保存待测。采用ELISA 法检测血清中5-HT、NE、BDNF 含量。操作严格遵循ELISA试剂盒说明进行。

1.8 TTC染色

麻醉大鼠后，取大鼠脑组织，放入-20 ℃冰箱冷冻30 min。用磷酸盐缓冲盐溶液配置1%红四氮唑溶液（TTC，W/V），37 ℃水浴至TTC 溶解，将脑组织按2 mm 厚度冠状切片，置于10 mL TTC 溶液中，37 ℃避光恒温孵育10 min。每隔10 min 翻动脑片使其染色均匀。正常脑组织TTC 染色后呈现红褐色，缺血梗死区呈现苍白色。经Image Pro Plus 6.0专业图像分析软件处理、分析，计算大鼠脑梗死体积百分比。

1.9 ELISA法检测海马5-HT、NE和BDNF含量

血清检测结束后，处理动物，取各组大鼠海马组织10 mg，加入100 μL匀浆液，安置于液态氮中反复冻融3次，每次持续10 min，再于冰浴中超声12 s，然后3 500 r/min 离心10 min，取上清液，采用ELISA法进行测定。

1.10 统计学方法

采用SPSS 22.0 对数据进行处理。计量资料符合正态分布使用（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验；重复测量资料比较采用重复测量方差分析。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 行为学结果

2.1.1 3组旷场试验结果比较见表1～3。

表1 3组旷场试验方格穿越格数比较（±s）Table 1 Comparison of grid crossing number of open field test in three groups（±s）

注：与同期假手术组比较，1）P＜0.001；与同期模型组比较，2）P＜0.05；与本组第1天比较，3）P＜0.05；与本组第4天比较，4）P＜0.05。Notes:Compared with the sham operation group in the same period,1)P<0.001;compared with the model group in the same period,2)P<0.05;compared with the first day of this group,3)P<0.05;compared with the fourth day of this group,4)P<0.05.

第7天68.88±12.43 13.63±5.321）3）4）32.25±9.391）2）3）4）F组间=91.617 P组间<0.001组别假手术组模型组梓醇干预组F值P值n888第1天65.38±13.62 13.13±4.731）13.25±5.651）F交互=12.196 P交互<0.001第4天66.13±10.26 13.50±8.371）3）21.63±7.331）2）3）F时间=21.825 P时间<0.001

表2 3组旷场试验站立次数比较（±s）Table 2 Comparison of standing times of open field test in three groups（±s）

第7天9.00±4.81 2.50±1.311）3）4）5.13±1.811）2）3）4）F组间=13.001 P组间<0.001组别假手术组模型组梓醇干预组F值P值n888第1天7.25±4.30 2.36±1.411）2.13±1.961）F交互=1.314 P交互<0.05第4天8.50±3.78 2.00±1.601）3）3.88±1.731）2）3）F时间=4.603 P时间<0.05

表3 3组旷场试验移动总距离比较（±s）cmTable 3 Comparison of total moving distance of open field test in three groups（±s）cm

第7天662.68±86.94 264.35±65.631）3）4）450.18±50.531）2）3）4）F组间=110.541 P组间<0.001组别假手术组模型组梓醇干预组F值P值n888第1天663.70±91.77 227.00±45.711）291.77±77.731）F交互=5.220 P交互<0.05第4天652.03±89.75 248.45±58.701）3）344.61±60.391）2）3）F时间=9.543 P时间<0.05

由表1～3显示，干预方法与时间在旷场试验结果上存在交互作用（P＜0.05）；干预方法与时间在旷场试验结果上主效应显著（P＜0.05）。与假手术组相比，模型组与梓醇干预组方格穿越格数、站立次数、移动总距离明显降低，差异具有统计学意义（P＜0.001），说明造模成功，干预后仍存一定神经功能损伤；与模型组相比，干预后第4 天、第7 天梓醇干预组方格穿越格数、站立次数、移动总距离显著升高，差异具有统计学意义（P＜0.05），说明地黄梓醇干预后大鼠活动量明显增加，缓解抑郁症状。

2.1.2 3 组大鼠高架十字迷宫测定结果比较见表4和表5。

表4 3组高架十字迷宫测定OE%比较（±s）%Table 4 Comparison of OE%of elevated plus maze measurement in three groups（±s）%

第7天47.76±7.90 20.88±7.471）3）4）33.70±5.721）2）3）4）F组间=42.825 P组间<0.001组别假手术组模型组梓醇干预组F值P值n888第1天48.83±7.68 19.23±7.631）18.05±7.901）F交互=5.817 P交互<0.05第4天46.05±9.06 19.57±7.521）3）27.87±7.721）2）3）F时间=5.921 P时间<0.05

表5 3组高架十字迷宫测定OT%比较（±s）%Table 5 Comparison of OT%of elevated plus maze measurement in three groups（±s）%

第7天49.03±7.90 20.93±7.801）3）4）32.50±7.191）2）3）4）F组间=38.442 P组间<0.001组别假手术组模型组梓醇干预组F值P值n888第1天49.01±10.73 20.74±6.701）20.52±6.561）F交互=4.398 P交互<0.05第4天50.94±7.77 19.90±8.781）3）28.88±7.741）2）3）F时间=4.674 P时间<0.05

由表4 和表5 显示，干预方法与时间在高架十字迷宫测定结果上存在交互作用（P＜0.05）；干预方法与时间在高架十字迷宫测定结果上主效应显著（P＜0.05）。与假手术组相比，模型组与梓醇干预组OE%、OT%显著降低，差异具有统计学意义（P＜0.001），说明造模成功，干预后仍存在一定功能损害；与模型组相比，干预后第4 天、第7 天梓醇干预组OE%、OT%明显升高，差异具有统计学意义（P＜0.05），说明干预后大鼠更愿意进入开放臂且停留更长时间，表明焦虑程度降低。

2.2 外周及中枢5-HT、NE及BDNF表达

2.2.1 3 组血清5-HT、NE 及BDNF 水平比较见表6～8。

表6 3组血清5-HT水平比较（±s）ng/mLTable 6 Comparison of serum 5-HT levels in three groups（±s）ng/mL

第7天419.10±36.83 218.61±32.191）3）4）367.28±20.391）2）3）4）F组间=176.656 P组间<0.001组别假手术组模型组梓醇干预组F值P值n888第1天412.39±33.99 147.79±39.331）143.53±26.361）F交互=39.267 P交互<0.001第4天410.25±38.00 200.15±34.111）3）294.11±22.281）2）3）F时间=94.150 P时间<0.001

表7 3组血清NE水平比较（±s）ng/mLTable 7 Comparison of serum NE levels in three groups（±s）ng/mL

注：与同时期假手术组比较，1）P＜0.001。Notes:Compared with the sham operation group in the same period,1)P<0.001.

第7天371.28±27.43 183.67±26.961）180.76±28.581）F组间=370.797 P组间<0.001组别假手术组模型组梓醇干预组F值P值n888第1天370.73±27.20 173.63±21.191）174.02±24.261）F交互=0.162 P交互>0.05第4天377.27±22.87 179.41±39.301）173.55±24.791）F时间=0.749 P时间>0.05

表8 3组血清BDNF水平比较（±s）ng/mLTable 8 Comparison of serum BDNF levels in three groups（±s）ng/mL

第7天152.21±12.24 72.22±14.971）3）4）91.60±11.371）2）3）4）F组间=133.523 P组间<0.001组别假手术组模型组梓醇干预组F值P值n888第1天157.42±15.52 72.13±11.921）70.48±11.621）F交互=8.219 P交互<0.001第4天157.60±11.99 71.83±12.171）3）86.34±10.181）2）3）F时间=4.498 P时间<0.05

由表6～8显示，干预方法与时间在5-HT、BDNF结果上存在交互作用（P＜0.05）；干预方法与时间在5-HT、BDNF 结果上主效应显著（P＜0.05）。与假手术组相比，模型组与梓醇干预组5-HT、NE、BDNF显著降低，差异具有统计学意义（P＜0.001）；与模型组相比，干预后第4 天、第7 天梓醇干预组5-HT、BDNF 明显升高，差异具有统计学意义（P＜0.05）；干预后第4 天、第7 天梓醇干预组与模型组NE 含量比较，差异无统计学意义（P＞0.05），说明地黄梓醇可以改善PSD大鼠外周血5-HT、BDNF含量。

2.2.2 3组海马组织5-HT、NE和BDNF水平比较见表9。

表9 3组海马组织5-HT、NE和BDNF水平比较（±s）ng/mLTable 9 Comparison of 5-HT，NE and BDNF levels in hippocampus in three groups（±s）ng/mL

注：与假手术组比较，1）P＜0.05；与模型组比较，2）P＜0.05。Notes:Compared with the sham operation group,1)P<0.05;compared with the model group,2)P<0.05.

BDNF 51.93±13.46 21.25±16.471）37.33±12.771）2）9.184<0.05组别假手术组模型组梓醇干预组F值P值n888 5-HT 513.72±69.37 313.50±52.411）399.90±56.961）2）22.403<0.05 NE 6.38±0.53 3.81±0.911）4.48±1.091）18.431>0.05

由表9显示，与假手术组相比，模型组与梓醇干预组5-HT、NE、BDNF显著降低，差异具有统计学意义（P＜0.05）；与模型组相比，梓醇干预组5-HT、BDNF 明显升高，差异具有统计学意义（P＜0.05）；梓醇干预组与模型组NE 含量比较，差异无统计学意义（P＞0.05），说明地黄梓醇可以改善PSD大鼠海马5-HT、BDNF含量。

2.3 3组脑梗死体积比较

见图1～2。

图1 3组脑片TTC染色结果Figure 1 TTC staining results of brain slices in three groups

由图1～2可知，模型组及梓醇干预组大鼠出现明显脑梗死区域，治疗后梓醇干预组脑梗死区域缩小，与模型组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。

3 讨论

图2 3组大鼠脑梗死体积百分比比较Figure 2 Comparison of cerebral infarction volume radio in three groups

PSD是以情绪低落为主要临床表现的中风后并发症，5年内的综合发生率为31%［9］。随着对中风患者的功能康复与生活质量的重视，近年来越来越多学者关注本病并取得一定研究进展，颅脑影像学检查也发现抑郁患者额叶、颞叶海马结构等功能与体积的改变，影响单胺类神经递质（5-HT、NE 等）及BDNF 的含量，抗抑郁治疗可促进海马区神经干细胞发生，增加突触可塑性［10］。导致PSD 的原因复杂，包括生物学机制、遗传机制、社会心理学机制等［1］。其继发于中风，存在脑器质性损伤，且引起的各种功能障碍加重“无力、无用、无望”等抑郁核心症状。因此本病的治疗是个系统工程：在神经生物学角度，应从神经功能康复与神经内分泌因子调控入手；在社会心理学角度，应从改善家庭与社会支持系统，提高支持能力入手。康复训练不仅仅促进神经功能恢复，而且可以促进神经细胞分泌内啡肽等“快乐因子”调控情绪5-HT、NE 等神经内分泌因子分泌正常，患者康复意愿提升，又能促进患者肢体、吞咽等缺损功能康复，二者相辅相成。基于此，本项目基于前期研究基础，探讨地黄梓醇在神经血管单元保护的同时，是否还具有情绪相关因子调节作用。

地黄是治疗中风病经典方剂如一贯煎、地黄饮子、血府逐瘀汤等的主要组成药物。梓醇作为其标志性功效成分，具有多样的生物活性，前期研究中发现其通过多途径实现神经元、微血管等多成分保护作用［11-13］。有研究表明地黄醇提物以及药渣水提物（主要为梓醇等环烯醚萜类与多糖类成分）具有潜在的抗抑郁效果，其作用机制可能涉及单胺能神经系统［14］。本研究采用MCAO 联合CUMS诱导抑郁样行为建立PSD 大鼠模型，以旷场试验来评价模型的自发活动和抑郁状态。结果显示，模型组方格穿越格数、站立次数、移动总距离与假手术组相比明显降低，差异具有统计学意义（P＜0.05），说明大鼠出现抑郁样症状及行为；与模型组相比，干预后第4天、第7天梓醇干预组方格穿越格数、站立次数、移动总距离显著升高，差异具有统计学意义（P＜0.05），说明地黄梓醇可以明显增加大鼠的自发活动，缓解抑郁样症状。中风后抑郁患者时常伴有焦虑情绪，形成情绪冲突。高架十字迷宫测定则针对大鼠对陌生环境的好奇探究以及对高度的恐惧心理之间的矛盾来考察大鼠的焦虑状态。因此本项目组通过高架十字迷宫观察模型的焦虑行为及干预效果。结果显示：对比假手术组，模型组与梓醇干预组OE%、OT%显著降低，差异具有统计学意义（P＜0.001），提示MCAO 联合CUMS 造模不仅使大鼠表现出抑郁样行为，同时还伴有焦虑情绪，与临床实际情况相符；与模型组相比，干预后第4 天、第7 天梓醇干预组OE%、OT%明显升高，差异具有统计学意义（P＜0.05），结果表明地黄梓醇对PSD 模型大鼠的抑郁样行为及焦虑症状均具有良好效果。TTC染色病理切片显示：地黄梓醇干预后大鼠脑梗死体积显著缩小（P＜0.05），表现出脑保护作用。

对于其作用机制的探讨本项目组采用外周与中枢相结合、宏观与微观相结合过程性观测模式：外周血5-HT、NE、BDNF 含量观测时间点与行为学时间点观测相匹配；同时与中枢关键脑组织的5-HT、NE、BDNF含量相对比，从神经功能修复与抑郁相关神经内分泌因子调控角度进行观测。结果提示：对比模型组，干预后第4 天、第7 天梓醇干预组5-HT、BDNF 明显升高，差异具有统计学意义（P＜0.05）；干预后第4 天、第7 天梓醇干预组与模型组NE 含量比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。处死后取海马区脑组织匀浆，使用ELISA 法测定，结果提示：对比模型组，梓醇干预组5-HT、BDNF 明显升高，差异具有统计学意义（P＜0.05）；梓醇干预组与模型组NE含量比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。说明地黄梓醇可以提高卒中后抑郁大鼠外周及中枢5-HT、BDNF水平，而对NE改善作用不明显。5-HT属于抑制性神经递质，在令交感神经节前纤维兴奋的同时，又能使副交感神经节前纤维抑制，其含量降低会造成精神、神经系统的功能紊乱，从而导致抑郁的产生［15-16］。BDNF 能加速海马神经元轴突、树突的萌发，使突触间的神经递质传递增强放大，影响神经元的可塑性［17］。BDNF的表达可以作用于5-羟色胺能传递［18］，通过TrkB 和p75NTR 这2 个受体系统介导的复杂下游信号级联反应实现［19］。

关于地黄梓醇对中风后抑郁的研究，目前尚无研究报道。本研究表明，地黄梓醇干预表现的抗中风后抑郁可能效应，与5-羟色胺能系统与脑源性神经营养因子调控有关，而与去甲肾上腺素能系统无关，是只与TrkB和p75NTR受体系统之一有关，还是有其他可能存在共同的神经内分泌机制，有待进一步研究验证，这也是本项目组下一步的研究方向。