基于弱磁信号的赭曲霉毒素A定量检测方法研究

常鑫茹，惠延波，王 莉，赵旭燕

1.河南工业大学 电气工程学院，河南 郑州 450001

2.河南工业大学 机电工程学院，河南 郑州 450001

真菌毒素作为真菌的一种代谢产物[1]，具有致癌和致突变的危害，目前已经发现的真菌毒素已有400多种，赭曲霉毒素是其中毒性最强的一种，包括赭曲霉毒素A(OTA)和赭曲霉毒素B(OTB)两种类型，其中OTA分布最广，毒性最大，污染最为严重，因此OTA检测一直是粮食安全研究中的重要分支[2-3]。

现有的OTA检测方法包括免疫分析法和仪器法[4-6]，这些方法对仪器和检测人员要求较高，测试周期长，一定程度上限制了其在基层的推广和应用。纳米磁珠(MNPs)作为一种新型纳米材料，因具有独特的超顺磁性和可修饰性，被广泛应用于免疫检测和生物医学等方面[7-8]。陈艳荣等[9]将超顺磁性纳米粒子(SPMNPs)作为标记物的侧流免疫分析技术用于胃癌标志物的定量检测。Issadore等[10]将微霍尔传感器与微流控技术相结合，通过对MNPs的磁矩进行检测，实现对分析物的定量分析。在使用MNPs作为分析物的固相载体时，能够大幅度简化样本前处理所需步骤，缩短检测时间[11-14]。为了解决现有OTA检测方法中存在样本前处理流程烦琐、只能实现定性或半定量检测、灵敏度较低等问题，作者将MNPs作为标记物开发一种磁性层析试纸来检测OTA，不仅可以根据检测区域显色程度提高定性检测的准确性，还可以通过测量MNPs弱磁信号强度实现分析物定量检测。目前用于弱磁信号强度检测的传感器包括各向异性磁电阻(AMR)传感器、巨磁电阻(GMR)传感器和隧道磁阻(TMR)传感器[15]。TMR传感器相较于AMR传感器和GMR传感器来说功耗更低、精度更高、工作范围更大，不需要附加聚磁环结构，更适用于弱磁信号的检测[16-17]。基于利用TMR传感器的弱磁信号的OTA定量检测方法可用于现场即时检测，具有很好的应用前景。

1 材料与方法

1.1 试验材料

PM3-020超顺磁珠(180 nm)：上海奥润公司；OTA抗原抗体、PBST、EDC、NHS、BSA溶液以及层析试纸的结合垫、样品垫、PVC板、NC膜等：深圳三方圆生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

亥姆霍兹线圈：北京翠海佳诚磁电科技有限公司；USB25103数字磁力计：江苏多维科技有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 磁性层析试纸制作

取2 mg PM3-020磁珠用超纯水清洗后加入活化剂(EDC和NHS溶液)充分混匀，于37 ℃活化30 min，其间使磁珠保持悬浮状态，将活化后的磁珠磁分离并移去上清液，加入OTA抗体和偶联剂(PBST溶液)37 ℃振荡孵育3 h，加入PBST(含1% BSA)溶液，4 ℃过夜封闭磁珠，将封闭过的磁珠用超纯水清洗两次后磁分离得到磁珠抗体复合物，预处理样品垫和结合垫，于室温下自然晾干，在结合垫上喷涂偶联OTA抗体的免疫磁珠，NC膜上喷涂BSA-OTA为T线，羊抗鼠IgG为C线，两线之间相距10 mm，将上述材料在室温下干燥1 h后依次交叠2 mm粘在PVC板上，划为宽3.8 mm的试纸条封存备用。

1.3.2 检测位置优化

由于外加磁场为矢量场且与传感器敏感轴垂直，所以磁力计的检测位置对结果有很大影响，利用COMSOL Multiphysics仿真软件对磁力计的摆放位置进行优化，设置背景磁场为50 mT，提线距离(h)为1.0、1.5、2.0、2.5 mm，仿真结果如图1所示，由图1可以看出，提线距离越小，振幅越大，信号越强，为检测装置小型化考虑，选择h=1.5 mm作为磁力计最优检测位置。

图1 不同提线距离下磁珠响应信号Fig.1 Response signal of magnetic beads under different lifting distances

1.3.3 总体方案设计

基于弱磁信号的OTA检测系统总体方案设计如图2所示，使用亥姆霍兹线圈作为磁场发生器，线圈半径大小和两线圈之间间距均为20 cm，通电后线圈内部产生的磁场为均匀磁场，将试纸置于垂直磁场方向的中心位置上，在平行于试纸条且选择提线距离为1.5 mm的位置固定磁力计，沿X轴方向匀速移动试纸条，检测T线和C线上MNPs的响应信号并通过USB传输模块传递给上位机软件，使用MATLAB软件对磁信号进行分析处理，提取T线和C线上响应磁信号的比值(T/C)，并建立其与OTA浓度之间的关系，完成检测系统的构建。

图2 系统总体方案设计Fig.2 System overall scheme design

2 试验原理分析

2.1 磁性免疫层析技术

磁性免疫层析技术是指用MNPs代替传统的标记物来实现免疫层析[18-19]，带有磁珠抗体复合物的层析试纸由于其横向流动性可同检测物相结合，通过测量反应后磁性纳米粒子的响应信号实现对检测物质的定量检测。层析试纸通常包括样品垫、结合垫、NC膜、吸收垫和PVC板，如图3所示。结合垫上包含带有特异性抗体的磁珠抗体复合物，NC膜上面划有检测线(T线)和控制线(C线)作为固定抗体的捕获区，吸收垫提供驱动力，PVC板提供支持[20]。

图3 层析试纸结构图Fig.3 Structure diagram of chromatography test paper

2.2 磁性纳米粒子响应信号模型

对于多粒子体系而言，每一个颗粒的磁矩取向每时每刻都在变化，但由于磁珠本身具有超顺磁性，当外加激励磁场时，磁珠内部磁矩会在磁场作用下有序排列[21-22]。假设汇聚在T线上的磁珠均匀分布，由于y轴方向长度远远大于x轴方向的宽度，所以可以将其等效成线磁偶极子模型进行预测，模型如图4所示，线磁偶极子是由两条互相平行、长度相等但磁场方向相反的无限长线组成。

注：b为T线距y轴距离， h为传感器距x轴距离， ρ为磁偶极矩。

(1)

Hx(x,z)、Hz(x,z)为在x轴和z轴上磁场分量，

(2)

(3)

由式(2)、(3)可知，T线宽度一定时，磁场强度是磁偶极矩的函数，磁矩的大小取决于MNPs的磁化率和汇聚在T线上的MNPs的数量，磁化率一定时，汇聚在T线上的磁珠越多，磁珠被磁化产生的磁场强度就越大。

利用COMSOL Multiphysics软件建立线磁偶极子仿真模型，设置激励磁场强度为50 mT，使用AC/DC磁场模块对其进行网格剖分和耦合计算，得到模拟响应信号波形如图5所示，可以通过测量MNPs响应信号的峰值实现对分析物的定量检测。

图5 线磁偶极子响应信号波形Fig.5 Waveform diagram of response signal of linear magnetic dipole

3 试验结果分析

配制OTA质量浓度为0.1、1、2、3、4、5、6、10 ng/mL的系列标准液，并用试纸条进行检测，反应5 min，试验结果如图6所示，试纸条定性检测限为5 ng/mL，当样品溶液质量浓度≤5 ng/mL时，可以清晰地看到T线和C线两条红色带，随着样品中OTA质量浓度的升高，T线颜色逐渐变淡，当质量浓度大于5 ng/mL时，只能看到C线显色，这是由于OTA和T线上的BSA-OTA竞争结合MNPs标记抗体。因此，OTA质量浓度越高，T线处磁信号就会越弱，磁性层析试纸能够有效反映出样品中OTA含量的变化。

图6 不同质量浓度的OTA标准液层析结果Fig.6 Chromatography results of OTA standard liquid with different concentrations

在层析试纸条定性检测限内配制质量浓度为0.01、0.1、0.5、1、2、3、4、5 ng/mL的系列标准液并用纸条检测，使用USB25103数字磁力计采集T线和C线上的磁信号并传送至上位机，图7a、7c为质量浓度为0.1 ng/mL和1 ng/mL时原始磁信号波形图。从图7a、7c 可以看出，试验测量得出的磁信号波形同仿真结果一致，很好地证明了本方法的正确性和可行性。但由于试验环境不能完全彻底地实现磁屏蔽，导致得到的原始信号存在噪声干扰，同时因为磁力计内嵌TMR传感器存在温度漂移特性、地磁场和其他噪声等因素的影响，使检测到的磁信号基底值并不为零，存在基线漂移问题，因此首先需要对采集到的原始信号进行校正。

为了保证校正前后信号的形状、宽度不变，使用MATLAB中smooth函数对于原始磁信号进行平滑降噪处理，通过采用选定的平滑因子对原始磁信号进行滤波，选定的平滑因子相当于一个低通滤波器，通过低通滤波算法把输入信号中的高频成分拆除，从而使曲线变得光滑，滤波器的默认窗宽为5，之后使用最小二乘法对于降噪后的磁信号进行基线校正，相较于其他方法存在容易造成信号失真等问题，通过最小二乘法拟合出的基线能最大程度逼近原始信号，最小二乘法实现步骤：假设测量数据为x，拟合后数据为y，两者之间满足关系y=ax+c，设拟合后的误差平方和为Q(a,c)，则有

(4)

要使误差平方和Q(a,c)最小，采用求极值的方法分别对式(4)中a和c求偏导并使其偏导值为零，可以求出a，c的值并得到一条拟合直线作为基底，使用原始信号波形减去拟合的基线便可以得到校正后的信号波形图，图7b、7d为质量浓度0.1 ng/mL和1 ng/mL时对应的校正后的磁信号波形图。

注：b、d图中峰值加圈标记表示提取的C和T。

提取T/C值分析其与OTA质量浓度之间的关系并绘制标准化曲线，由图8a可以看出，T/C

图8 T/C同OTA质量浓度的关系Fig.8 Relationship between T/C value and OTA concentration

值同OTA质量浓度之间呈对数关系，将OTA质量浓度取对数，绘制标准化曲线如图8b所示，由图8b可知，两者之间呈良好的线性关系，R2=0.981 5，取10份OTA质量浓度为0 ng/mL标准液进行检测并计算T/C，测试的标准偏差为3.22%，按照美国国家标准局定义的检测标准，定性检测限为3倍的标准偏差，定量检测限为10倍的标准偏差，即该试纸条定性检测限为 0.10 ng/mL,定量检测限为0.32 ng/mL，线性检测范围为0.32～5 ng/mL，检测范围符合国标对OTA的限量标准，虽然线性范围较小，但检测1次所需要的时间仅为30 s，大大提高了检测效率。

4 结论

基于弱磁检测和免疫技术结合提出了一种新型赭曲霉毒素A定量检测方法，采用纳米磁珠作为标记物制作出一种新型的磁性层析试纸条，在亥姆霍兹线圈和数字磁力计构建的赭曲霉毒素A便携式检测装置下，通过测量层析试纸质控线和检测线弱磁信号强度实现了对赭曲霉毒素A的定量检测。该装置操作简便，完成1次检测的时间仅需30 s，与现有方法相比大大缩短了检测时间、提高了检测效率，可用于即时现场检测，为粮食毒素检测提供了一种新的方法。