建群蜂进入花序的时机不同对榕-蜂繁殖效益的影响

张宇豪，陈杨菲，陈友铃，吴文珊

(福建师范大学生命科学学院，福建省发育与神经生物学重点实验室，福建 福州 350117)

榕属植物是亚热带森林生态系统的重要组成成分，共有750多种.榕树的花序是闭合的隐头花序，需要传粉榕小蜂为其授粉，两者在长期的协同进化中形成了适应性结构[1-4].榕小蜂特殊的头部构造能顶开榕花序外苞片，通过苞口通道进入花序，产卵于雌花子房，并为大量雌花授粉，榕小蜂子代在雌花的胚珠中生长，在花序成熟时榕小蜂也发育至成虫期，离开花序前榕小蜂已在花序内完成了交配并取得了大量花粉，用于为新的花序传粉，这种互利共生的关系已被人们熟知.在日常采样中发现，细叶榕(FicusmicrocarpaLinn.f.)雄花期榕果数量极高，但其中大量榕果出飞的传粉榕小蜂(Eupristinaverticillata)寥寥无几，榕果内的种子数量也极少.已有研究结果表明：建群蜂进入雌花期花序的时间越迟，形成的种子数量和子代数量越少[5-8]；但Ding等[9]在钝叶榕(F.curtipes)雌花期不同时机为花序引入传粉榕小蜂，研究结果表明建群蜂进入雌花期花序的时间越迟种子数量越少，但子代数量呈现为先增加后减少的趋势；而Anstett[10]在对榕树(F.pertusaL.)的研究中认为，雌花期初期花序对榕小蜂的吸引力最强，但进蜂花序的子代数和种子数最少.本实验在细叶榕雌花期不同发育阶段，利用人工放蜂实验引入细叶榕传粉榕小蜂，观测花序生长过程中子代榕小蜂的发育状态，探究建群蜂进入花序的时机不同对榕-蜂繁殖效益的影响.

1 研究方法

实验样地位于福建省福州市闽侯县上街镇(119°20′31E,26°03′12N).2020年9月15日，在样地内选择1株株内发育较为同步的细叶榕，其花序(直径约1 mm，去掉太大或太小的)尚处于总苞片包裹中，用120目的尼龙网袋进行套袋，阻隔传粉榕小蜂进入花序传粉或产卵，阻隔非传粉榕小蜂产卵，排除昆虫、鸟类等其它因素对花序发育的影响.每10个花序一袋，共计套袋1 200个花序，将花序分为6组(组1-6)，每组200个花序.

每日观测并拍照记录苞片和雌花的发育状态，将花序突破总苞时设定为实验第1天，在花序突破总苞后的第3天，取下组1花序的套袋尼龙网，换上装有当日收集的榕小蜂的尼龙网(在样地内采集雄花期的细叶榕花序，置于120目的尼龙网中，待榕小蜂自然出飞后，剔除非传粉榕小蜂和体型太大或者太小的传粉榕小蜂，每个尼龙网储藏100头榕小蜂)，按花序数∶榕小蜂=1∶10的比例引入传粉榕小蜂；此后在第5、7、9、11、13天，依次为组2、3、4、5、6的花序引入传粉榕小蜂，在花序发育第13天，直至榕小蜂不再进入花序，停止放蜂.每组放蜂的花序，在引入传粉榕小蜂的24 h后取回花序解剖观察，花序腔内有传粉榕小蜂记为已进蜂(排除死于苞口或苞片层，未进入花序腔的榕小蜂)，统计进蜂率=进蜂花序数/花序总数×100%.

1.1 5龄幼虫期和成虫期榕小蜂死亡率统计

每日镜检已进蜂榕果内榕小蜂幼虫发育状态，在花序突破总苞的第28-34天幼虫发育至5龄，记录单果存活幼虫数，空瘿数(幼虫在幼虫期已死亡)；花序突破总苞第40-46天，建群蜂子代出飞，镜检虫瘿，将已出飞榕小蜂或已化蛹的榕小蜂记为存活，仅剩空瘿、虫瘿内存在榕小蜂干枯的外骨骼或腐烂的尸体记为成虫期子代死亡.

(1)记录5龄幼虫期榕小蜂幼虫死亡率=5龄期死亡幼虫/(5龄期死亡幼虫+5龄期存活幼虫数)×100%；

(2)记录成虫期榕小蜂死亡率=成虫期榕小蜂死亡数/(成虫期榕小蜂死亡数+存活榕小蜂数)×100%.

1.2 雄花期花序内榕小蜂、种子、败育花的取样与统计

每日检查能够进蜂的花序组内榕小蜂幼虫发育状态，花序突破总苞第40天发育至雄花期，此时花序变大变软，部分花序变红，花序内雄花成熟伸展至花序腔中心.在传粉榕小蜂已发育成熟且未出飞前采回花序，置于解剖镜下解剖花序，统计传粉榕小蜂雌、雄蜂子代数，空瘿数，种子数，败育花数，并计算：

(1)虫瘿总数=雌蜂数+雄蜂数+空瘿数；

(2)雌花总数=败育花+虫瘿总数+种子数；

(3)存活子代数=雌蜂数+雄蜂数；

(4)子代性比=雄蜂/(雌蜂+雄蜂)；

(5)雌花利用率=(虫瘿数+种子数)/(虫瘿数+种子数+败育花数)×100%；

(6)造瘿率=虫瘿总数/雌花总数×100%；

(7)结实率=种子数/雌花总数×100%.

1.3 自然出飞的子代榕小蜂体型测量

在花序突破总苞第40 d进入雄花期，传粉榕小蜂已发育成熟且未出飞前，取回花序，在实验室内收集几个组自然出飞的榕小蜂子代雌蜂，放至低温下冻死后取出置于载玻片上摊开侧放，使用生物显微镜(Olympus BX51)、显微成像系统(SteREOlumar V12)对榕小蜂子代拍摄，使用测量软件(Image-Pro Plus)测量榕小蜂子代体长.

利用Excel2016和SPSS21软件对实验数据进行统计学分析和作图.

2 结果

2.1 不同时机放蜂的花序状态和进蜂情况

花序在发育过程中，雌花和苞片形态不断发生变化.6个实验组引入榕小蜂时的雌花状态、苞片形态和进蜂情况如下：组1花序尚处于雌前期，雌花花柱和柱头直挺，柱头表面光滑(图1，A)，外苞片将苞口完全封闭，中间苞片间隙大，内苞片在花序腔疏松排列(图1，B)，此时榕小蜂无法进入花序；组2花序已处于雌花期初期，花柱和柱头出现小角度弯折，柱头表面出现乳状突起(图1，C)，外苞片开裂，裂口平整，螺旋状排列层叠紧密，中间苞片间隙小，四周的内苞片向中间靠拢(图1，D)，此时进蜂率22%，进蜂果的单果进蜂量均为1头；组3花序处于雌花期中期，雌花花柱和柱头大角度弯折，柱头表面遍布乳状突起(图1，E)，外苞片轻微上翘，中间苞片层叠疏松，内苞片在花序腔相互交叠(图1，F)，此时进蜂率100%，平均单果进蜂量1.6头，单个花序最多有3头榕小蜂进入.组4花序同样处于雌花期中期，柱头伸长盘绕，柱头表面遍布的乳状突起伸长(图1，G)，外苞片变为平整，中间苞片保持疏松层叠，内苞片相互交织(图1，H)，此时进蜂率100%，平均单果进蜂量1.4头；组5花序处于雌花期末期，柱头上伸长的突起出现轻微粘连的现象(图1，I)，外苞片平整，中间苞片层叠密集，内苞片分离，不再呈交叠状(图1，J)，此时进蜂率44%，平均单果进蜂量1头；组6花序处于末花期，柱头失水，雌花期伸长的突起变为粘连状(图1，K)，外苞片封闭，中间苞片间隙大，内苞片分离(图1，L)，此时榕小蜂无法进入花序.依据雌花、苞片形态和花序进蜂情况，表明细叶榕雌花期时长为7 d.

A: 组1雌花；B: 组1苞片；C: 组2雌花；D: 组2苞片；E: 组3雌花；F: 组3苞片；G: 组4雌花；H: 组4苞片；I: 组5雌花；J: 组5苞片；K: 组6雌花；L: 组6苞片(ob: 外苞片outer bract；mb: 中间苞片middle bract；ib: 内苞片inside bract)

2.2 建群蜂进入花序的时机不同对造瘿数和子代榕小蜂存活率的影响

从表1可以看出，建群蜂在雌花期中期进入花序，其造瘿数较高，但其子代的死亡率也较高.子代5龄幼虫期死亡率较高(15%～17%)，可能是幼虫期发育需要摄入大量营养，在资源利用的争夺中，获取营养能力差的子代大量死亡.

表1 建群蜂造瘿数及子代榕小蜂的存活情况

而从5龄幼虫发育至羽化出飞时死亡率仅为7.8%～9.0%，且镜检表明均为空虫瘿壳，未发现子代的尸体或几丁质外壳残留，即5龄幼虫期发育至成虫期过程中死亡的子代，都集中在化蛹阶段，化蛹过程中虫体会发生剧烈的生理变化，因而导致大量集中死亡，成功进入蛹期的榕小蜂至羽化出飞前不再发生较大的形态变化亦不再需要进食，因此几乎不发生死亡.

2.3 建群蜂进入花序的时机不同对雌花利用率和榕果产出的影响

由表2可以看出，建群蜂在雌花期中期进入花序时，造瘿率和结实率均达到最高；雌花期中期的两个组，较早进入花序的组3，造瘿率、结实率要高于组4；雌花期初期造瘿率小于雌花期中期，结实率与雌花期中期的组4不存在显著性差异；雌花期末期造瘿率与结实率极显著小于雌花期中期.

表2 建群蜂进入花序的时机不同对雌花利用率和榕果产出的影响

建群蜂在雌花期中期进入花序时，雌花利用率最高；在雌花期末期进蜂时结实率较低，导致雌花利用率极显著低于雌花期初期；建群蜂在任何时机进入花序，形成的虫瘿数均多于种子数.

2.4 建群蜂进入花序的时机不同对榕小蜂子代的影响

由表3可以看出，当建群蜂在雌花期中期进入花序产卵时，其子代数量高，体长较长；当建群蜂在雌花期初、末期进入花序产卵时，两者之间的子代数量无显著差异，但显著低于雌花期中期，其中子代雄蜂数差异不显著，子代数量的变化主要表现在雌蜂数量的极显著减少，这也直接导致了雌花期中期产卵的性比低于雌花期初期和雌花期末期；当建群蜂在雌花期初、末期进入花序产卵时，两者之间的子代体长无显著差异，但极显著低于雌花期中期.

表3 进蜂时机对子代发育的影响(单果)

3 讨论

本研究通过人工控制传粉榕小蜂进入花序时机，确定了细叶榕雌花期时长为7 d.从不同时机花序结构、进蜂率可以看出，外苞片开裂是传粉榕小蜂进入花序的前提，在花序发育过程中苞片依次从封闭、开裂、松散后又回复紧闭状态，直接影响榕-蜂繁殖成功的概率.花序发育不同阶段产生不同组成和浓度的挥发物，是传粉榕小蜂对花序趋避行为的主要影响因子[5]，结合榕-蜂繁殖效率表明，雌花期中期为最佳进蜂时机.雌花期初期和末期进蜂，均导致进蜂率、造瘿数(雌蜂数)、子代体长的极显著下降，而雌花期末期进蜂的榕果的结实率较初期极显著下降.

3.1 雌花期初、末期进蜂对榕-蜂繁殖效益的影响

雌花期初期的花序苞口未完全开放、雌花未全部成熟，而雌花期末期的花序苞口开始闭合、雌花开始萎蔫，均造成建群蜂进入花序的难度加大，花序释放的挥发物对榕小蜂的吸引力减小，建群蜂进入花序内需耗费更多时间和体力[6,11-12]，因此进入雌花期初期、末期花序的榕小蜂在花序内用于产卵和授粉的寿命减少[13]，从而导致造瘿数和结实率极显著下降.雌花期初期的花序腔狭小，可能限制了复杂的产卵行为[14]，而对相对简单的主动传粉行为没有显著的影响[15]；雌花期末期的花序腔虽然增大，但衰老的雌花柱头出现失水粘连现象，阻碍了榕小蜂产卵[16]，失水的柱头即使被授粉，花粉粒也难以萌发，极易败育，实验结果表明柱头失水粘连对授粉的影响显著大于造瘿.

3.2 影响子代榕小蜂发育的因素

进蜂1-3头的细叶榕榕果，其榕小蜂在幼虫期或化蛹期的死亡率并没有显著差异，表明榕果提供的营养物质是榕小蜂存活的限制因子，因此在雌花期中期单果进蜂数更多的榕果的榕小蜂死亡率更高；由于建群蜂进入花序后先产雄性后代[17]，子代雄蜂优先获得营养资源，且雄蜂发育周期比雌蜂短[18]，因此不同进蜂时机的子代雄蜂死亡率变异小，而子代雌蜂的死亡率波动大.

榕小蜂体长受遗传和营养摄入影响[19-21]，雌花期初、末期的外苞片层叠紧密，阻碍了个体较大的榕小蜂钻入，所以，被苞口筛选后的“小型”建群蜂的子代体长较小；榕小蜂的生长发育依赖子房组织提供营养，雌花期初期尚未完全生长的胚珠，以及雌花期末期开始败育的胚珠，均不利于榕小蜂获取养分.