制备荧光量子点应用于石菖蒲挥发油中细辛醚的含量测定*

益西拉姆 罗珍 达瓦 靳贵林 冯明科

（西藏藏医药大学，西藏 拉萨 850000）

石菖蒲为一味开窍醒神的良药，其药理的主要有效成分主要是挥发油提取物，其中含有挥发性成分α-细辛醚(α-asarone)、β-细辛醚(β-asarone)、甲基丁香酚(methy lequens)等物质［1-3］。研究表明石菖蒲挥发油对中枢神经系统具有兴奋、抑制的双向调节作用，药理机制上保护神经元、提高血脑屏障通透性的机理。石菖蒲挥发油除有较好的益智、脑保护作用外，对心血管系统有明显的保护作用，且还有平喘、增强肠管蠕动、抑制吗啡戒断症状等作用［4-6］。

本研究旨在通过建立一种荧光探针进行特异性分析与检测的分析模型，对石菖蒲的中的细辛醚进行分析鉴定与含量检测。日渐成熟的荧光分析法由于操作简单、特异性好、灵敏度高的特点，在推动民族医药的研究中越发重要。通过建立一种荧光探针分析检测的方法，可以克服天然药物成分复杂、难以分析鉴定的特点，能够快速对其成分进行分析与含量测定，对于进一步研究该药物的药理作用提供了前提基础。

1 材料和方法

1.1 所用试剂及仪器

试剂：石菖蒲产地四川，自然阴干后粉碎（过40目筛），β-细辛醚对照品（纯度70%），美国Sigma-Al‐drich 公司，CO2为食品级［w（CO299.9%）］，其它试剂均为分析纯。

仪器设备：1L 超临界萃取装置，来自中国广州轻工研究所。所有的荧光光谱分析都是通过日立F-7000荧光分光光度计（日本东京）进行测定，激发和发射狭缝为5/5 nm，检测池为1cm×1cm。紫外/可见吸收光谱由紫外-2450 分光光度计测定（日本东京），pHS-3C 数字pH 计用于测定溶液的pH 值（中国上海），绝对PL 量子产率光谱仪C11347（日本Hama‐matsu）用于测定量子产率，碳量子点的粉末通过Pi‐loFD8-4.3V（美国Charlotte）中进行冻干后获得。

1.2 实验方法

提取方法。超临界CO2萃取法（SCE）:石菖蒲粉料200.00g,超临界CO2流速2.5L/h,提取压力6.0MPa，提取温度45℃，恒温恒压萃取2h，出料得浅黄色透明液体，重复以上实验3次，计算挥发油平均得率。

碳量子点的合成。0.5 g 尿素和1.0 g 二甲双胍溶解在6 mL 的水中，将混合溶液依次转移到25mL 内衬聚四氟乙烯的不锈钢高压釜，随后在180℃下反应6h。冷却至室温后将粗产物溶解于10mL超纯水中。将之前的溶液以3000 rpm离心3 min，将上清液用0.22 mm滤膜过滤以此除去较大的产物。再通过100 MWCO的透析膜透析12 h，最后通过冻干得到灰色的CDs粉末［7-12］。

样品检测。随后将两个平行的200 μL 的CDs（1 mg/mL）和800 μL 的DMF 依次加入1.5 mL 的样品管中。将200 μL 的待测品（10-4M）加入到之前的溶液中并进行充分涡旋混合，然后将上述混合物分别孵育5min后进行荧光测定。

2 结果分析

2.1 表征与线性

首先对所制备的荧光碳量子点进行荧光光谱表征，从荧光光谱来看，所制备的碳量子点激发首先对所制备的CDs 进行表征，CDs 在400nm 激发时表现出最大发射波长455 nm 的蓝色荧光（图1A），此外可以观察到CDs 在365 nm 的紫外下发出蓝色荧光（图1A a,b）。此外通过HR-TEM 图像显示所制备的CDs 类似于球形，通过DLS 可以测得直径主要位于4～9 nm范围内，阐述了所合成的CDs 是均匀的且具备良好分散性（图1B）。通过加入不同的细辛醚后扫描得到不同的荧光曲线（图1C），可以看到响应范围从4×10-7M到6×10-4M 浓度下具有良好的线性范围(图1D)。通过拟合可以得到浓度与荧光强度的线性曲线，基于此建立了采用荧光碳量子点分析细辛醚的方法［13-15］。

2.2 样品分析

将通过超临界CO2萃取得到的挥发油样品进行处理［16］，首先提取物通过DMF 溶解，经过0.22 μm 的滤膜进行过滤，然后将溶液稀释成不同浓度的样品，稀释至原溶液的10-6倍，加入将200 μL 的各种浓度的样品加入到之前的溶液中并进行充分涡旋混合，然后将上述混合物分别孵育5min后进行荧光测定，将得到的结果与建立的回归曲线进行拟合［17-20］，得到细辛醚含量结果如表1。

表1 细辛醚含量占比

从表1 的结果来看，通过超临界萃取200g 的石菖蒲粉体大约能得到挥发油的量为2.2g，挥发油含量约为总体质量的1%.与先前的文献相比，超临界萃取方法的提取率明显高于蒸馏法以及微波法。通过荧光分析法计算出挥发油中细辛醚的含量为2.24 g 左右，占挥发油总量的70.89%.通过该方法对三次超临界提取后挥发中的细辛醚进行分析，结果均具备良好的重现性，结果阐明了基于荧光量子点应用于石菖蒲中挥发油的检测的方法被成功建立。

3 结论

本研究基于所制备的荧光碳量子点对于细辛醚的特异性响应，建立了不同浓度的细辛醚与荧光碳量子点的线性曲线，进而得到了细辛醚浓度对荧光强度之间的回归方程。通过超临界萃取法从石菖蒲中提取出挥发油，利用所拟合的回归方程计算出挥发油中细辛醚的含量，结果表明石菖蒲挥发油中细辛醚含量占比为70%左右。分析结果体现了实验中使用的该产地石菖蒲品质较好。