双奇保肺颗粒治疗慢性阻塞性肺病机制的网络药理学研究

郑 夺，王 露，贾淑杰，陈 冠*

（1.天津市医药科学研究所，天津 300020； 2.天津市海河医院，天津市呼吸疾病研究所，天津 300350）

近年来呼吸系统疾病发病率及病死率呈逐年上升趋势，其中以慢性阻塞性肺疾病（COPD）为主的呼吸系统疾病，病情易反复，病程长，且由于COPD 患者长时间处于慢性炎症状态，并产生大量炎性因子，导致中性粒细胞产生，引发粒细胞增殖与活化，容易诱发和加速并发症的形成和发展［1-2］。

临床针对COPD 患者，通常采用支气管扩张剂、全身糖皮质激素及抗生素等为主的药物进行强化和维持治疗，以达到改善肺功能、解痉平喘的目的，但维持治疗阶段临床患者经常出现依从性差，自身防御和免疫功能降低，产生心肺并发症等，治疗效果不理想［3-4］。中医药对呼吸系统疾病的治疗，体现出中医药治慢病的优势与特色。双奇保肺颗粒（SQBF）由生石膏、麻黄、苦杏仁、甘草、蜜桑白皮、黄芩、鱼腥草、龙葵、千日红、炒僵蚕、地龙等组成，具有清热化痰、止咳平喘的作用［5］，具有副作用小、疗效显著的特点，从整体出发，从多个角度及作用途径进行综合治疗。

网络药理学分析方法能够在系统水平上，揭示中药复方通过多成分、多靶标而对机体发挥全方位、整体的调控作用机制。本研究采用网络药理学方法，通过搜索数据库收集SQBF 包含的化合物及其相对应的靶标，构建和分析靶标网络，确定网络中的重要靶标，并对重要靶标进行功能富集分析，确立与COPD 之间的关联作用，从分子水平阐明SQBF 治疗COPD 的机制。

1 方法

1.1 慢性阻塞性肺病靶点的筛选 通过TTD、Drugbank、DisGeNET、GAD、KEGG 数据库筛选慢性阻塞性肺病（COPD）相关靶点。

1.2 双奇保肺颗粒化学成分的筛选 本研究通过TCMSP 数据库、检索双奇保肺颗粒处方组成中15 味中药（甘草、当归、紫菀、苦杏仁、马兜铃、旋覆花、防风、麻黄、千日红、龙葵、桑白皮、鱼腥草、黄芩、瓜蒌、白果）的主要功效成分，以口服生物利用度OB≥30%、类药性DL≥0.18 和药物半衰期≥4 h 对上述成分进行筛选；通过TCMID 数据库及文献获取其他4 味中药石膏、僵蚕、全蝎和地龙的主要化学成分。

1.3 双奇保肺颗粒靶点预测 通过TCMSP 数据库和SEA 数据库获取双奇保肺颗粒化学成分的预测靶点，通过Uniprot 数据库寻找适用物种为人的蛋白靶点。

1.4 双奇保肺颗粒-疾病-靶点的合并 将获得的双奇保肺颗粒化合物靶点与COPD 相关靶点取交集，得到双奇保肺颗粒作用COPD 的靶点。

1.5 双奇保肺颗粒-疾病-靶点的PPI 网络的构建 为了明确双奇保肺颗粒对疾病靶点蛋白在系统水平上的相互作用，构建双奇保肺颗粒-疾病靶点的PPI 网络。将获得的交集靶点导入String 数据库中，限定物种为“Homo sapiens”，将评分条件设置为＞0.90，剔除离散蛋白节点，获取蛋白质-蛋白质相互作用网络并保存为TSV 文件格式。获取的数据导入Cytoscape 软件进行可视化分析。

1.6 聚类分析 通过 MCODE 插件对双奇保肺颗粒-疾病-靶点进行聚类分析。

1.7 双奇保肺颗粒-疾病-靶点的GO 和KEGG 富集分析 将获得的 113 个双奇保肺颗粒-疾病靶点导入Metascape 在线分析网站对其进行GO 和 KEGG富集分析，最后将富集分析得到的结果导入Cytoscape 软件进行可视化分析。

2 结果

2.1 疾病相关靶点 通过TTD 数据库获取COPD 相关靶点 64 个、Drugbank 78 个 、DisGeNET 355 个、GAD 17 个、KEGG 数据库 3 个，去重后共获得疾病相关靶点458 个。

2.2 复方成分与靶点 复方共包含278 个名称不同的化合物，其中甘草83 个、当归2 个、紫菀12 个、苦杏仁 6 个、马兜铃 10 个、旋覆花 18 个、防风 10 个、麻黄 6 个、千日红 2 个、龙葵 7 个、桑白皮 21 个、鱼腥草6 个、黄芩 50 个、瓜蒌 10 个、白果 19 个、石膏 1 个、僵蚕4 个、全蝎11 个和地龙7 个，对应不同的靶标694 个。各中药成分化合物和靶标个数见表1。

表1 双奇保肺颗粒包含的化合物和对应的潜在靶标个数（去重）

结果证实，双奇保肺颗粒中不同活性化合物可作用于相同的靶点，同一个活性化合物也可作用于不同的靶点，反应其多成分、多靶点干预慢性阻塞性肺病的作用模式。将694 个靶点与COPD 相关的药物靶标对比分析，交集归纳得到113 个与COPD 治疗相关的潜在作用靶点。见图1。

图1 复方成分-疾病-靶点网络

2.3 复方-疾病-靶点PPI 网络构建与聚类分析结果 将共有的113 个双奇保肺颗粒-疾病-靶点导入String数据库中并将评分条件设置为＞0.90，得到复方治疗COPD 的PPI 网络，该网络图中共有95 个节点，321条边，Cytoscape 可视化结果见图2。

图2 复方-疾病-靶点PPI 可视化网络

利用Cytoscape 软件中的Network Analyzer 插件计算网络节点degree，得到排名前20 位的靶点分别为：STAT3、IL6、TNF、CXCL8、NFKB1、IL1B、MAPK1、MAPK14、MAPK3、VEGFA、IL10、EDN1、TP53、MMP9、PTGS2、TIMP1、IL4、CCL2、TGFB1、NR3C1。通过MCODE插件进行聚类分析后发现，双奇保肺颗粒治疗慢性阻塞性肺病治疗靶点主要分为7 个聚类，见表2。

表2 双奇保肺颗粒治疗COPD 靶点聚类分析

2.4 双奇保肺颗粒-疾病-靶点GO 和KEGG 分析 使用Metascape 数据库对Cluster 1 的10 个核心靶点（STAT3、IL6、TNF、CXCL8、IL1B、IL10、IL4、CCL2、CXCL2、ICAM1）进行生物信息学分析，结果表明双奇保肺颗粒在干预和治疗慢性阻塞性肺病过程中主要参与：慢性炎症反应的调节、白介素相关信号通路、细胞因子与炎症反应、上皮细胞凋亡过程的调控、白细胞迁移、miRNA 参与败血症的免疫反应、Th17 细胞分化、内皮细胞凋亡过程的负调控、RNA 聚合酶Ⅱ对 primiRNA 转录的正调控、细胞对生长因子刺激的反应等过程；与趋化因子活性、受体结合，细胞因子活性、受体结合，生长因子活性、受体结合，G 蛋白偶联受体结合等分子功能有关。见图3。

图3 双奇保肺颗粒-疾病-靶点GO 富集分析气泡图

KEGG 富集分析结果显示，双奇保肺颗粒在治疗慢性阻塞性肺病的过程主要与Th17 细胞分化、IL-17 信号通路、细胞因子与细胞因子受体的相互作用、TNF 信号通路、NOD 样受体信号通路、NF-κB 信号通路、Toll样受体信号通路等信号途径有关。KEGG 分析图见图4。

图4 双奇保肺颗粒-疾病-靶点KEGG 富集分析气泡图

3 讨论

本研究通过网络药理学的方法，依托化合物、蛋白、生物信息注释等多个数据库，构建网络并对靶点通路进行富集分析，系统地探讨双奇保肺颗粒治疗慢性阻塞性肺病的作用机制，研究发现双奇保肺颗粒治疗慢性阻塞性肺病具有“多成分、多靶点、多通路”的作用特点。双奇保肺颗粒-疾病-靶点PPI 网络显示STAT3、IL6、CXCL8、NFkB1、TNF 等靶点在干预治疗慢性阻塞性肺病过程中发挥着重要作用。Th17 细胞的主要功能是促进中性粒细胞的动员、募集和活化，介导促炎症反应，一系列细胞因子如TGFB、IL6、IL-9、IL-1、IL-23、IL-21、STAT3 参与了 Th17 细胞分化过程。Seung-Hyung Kim［6］等通过实验证实中药组合物通过阻断IL-17/STAT3 途径调节炎症细胞因子和CXCL-2 的表达，从而更有效地抑制嗜中性气道炎症，说明筛选靶点可作用于炎症的发展进程。

本研究显示，双奇保肺颗粒可能是通过调控免疫相关通路：IL-17 信号通路、细胞因子与细胞因子受体的相互作用、TNF 信号通路、NOD 样受体信号通路、NF-κB 信号通路、Th17 细胞分化等信号途径，起到抑制活化的细胞因子、消除炎症的作用。

目前临床上治疗COPD 的药物种类繁多，作用机制及作用时间各有不同，合理选择能发挥协同作用的药物，制定合理有效的治疗方案，对COPD 的治疗及延缓病情进展至关重要［7］。研究过程中发现复方-疾病靶点相互作用网络中 MUC5AC、MUC1 靶点与STAT3 紧密关联。有研究发现气道黏蛋白MUC5AC和MUC5B 与COPD 患者的气道黏液浓度升高密切相关，在严重的气道阻塞状态下，MUC5AC∶MUC5B 的比率更高［8］，这与临床上双奇保肺颗粒的平喘的适应症相对应，有待于后期的深入研究和进一步验证。

综上所述，本研究应用网络药理学方法对双奇保肺颗粒的化学成分、作用靶点进行了系统性分析，从分子水平阐述了该复方多成分、多靶点对机体的整体调控，为其后续深入的机制研究提供了方向和理论依据。