HPLC-示差折光检测 1，2，3-三乙酰氧基-5-脱氧-β-D-核糖的有关物质的方法研究

王志鹏，陈丽君，唐 海，周 微

（江苏天士力帝益药业有限公司，天津 300410）

1，2，3-三乙酰氧基-5-脱氧-β-D-核糖是合成卡培他滨的关键中间体，其以D-核糖为原料，经过一系列反应合成 5-脱氧-β-D-核糖，再经过甲酰化得到［1-3］。因此，D-核糖与 5-脱氧-β-D-核糖是 1，2，3-三乙酰氧基-5-脱氧-β-D-核糖中潜在的杂质，需要建立分析方法进行研究。糖类物质多见于采用液相色谱-示差检测器进行常量检测［4-6］，作为杂质的检测文献报道较少［7-8］。本研究建立了以示差折光液相色谱法检测1，2，3-三乙酰氧基-5-脱氧-β-D-核糖中的 D-核糖以及5-脱氧-β-D-核糖，方法简便可靠，灵敏度高，具有重要的意义。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Agilent 1260 液相色谱仪（配示差折光检测器，美国安捷伦公司），chromeleon 7 色谱工作站（美国赛默飞公司）；XS105DU 电子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；超纯水系统（Millipore-Q，Millipore 公司）。

1.2 试药 1，2，3-三乙酰氧基-5-脱氧-β-D-核糖（连云港海恒生化科技有限公司，批号20180429、20180510、20180512、20180601、20180602、20180603）；D-核糖（连云港海恒生化科技有限公司，批号20170301，含量100%）；5-脱氧-β-D-核糖（连云港海恒生化科技有限公司，批号20170501，含量99.6%）；乙腈（色谱纯，德国 Merck 公司）；超纯水（Millipore-Q 制备）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Waters XBridge Amide 色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈-水（70 ∶30）；流速为 1 ml/min；柱温：40 ℃；进样量：100 μl；示差折光检测器温度40 ℃。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备 取5-脱氧-β-D-核糖及D-核糖适量，精密称定，加流动相溶解并稀释制成每1 ml 分别含0.1 mg 的混合溶液，作为杂质贮备液；精密量取杂质贮备液2 ml 置10 ml 量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备 称取样品约200 mg，精密称定，置10 ml 量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。

2.3 系统适用性试验 取上述“2.2”项下的对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液（流动相）。按照“2.1”项下的色谱条件分别进样，结果该色谱条件下的色谱峰形对称，理论塔板数为：4 955，符合2020 年版《中国药典》的相关规定。见图1。

图1 阴性样品（A）供试品（B）对照品（C）HPLC 色谱图

2.4 专属性试验 取1，2，3-三乙酰氧基-5-脱氧-β-D-核糖、D-核糖、5-脱氧-β-D-核糖适量，精密称定，用流动相溶解，分别进样，1，2，3-三乙酰氧基-5-脱氧-β-D-核糖出峰时间为2.662 min，D-核糖出峰时间为4.820 min，5-脱氧-β-D-核糖出峰时间为3.867 min，主峰与各杂质可以有效分离。

2.5 检测限与定量限 采用逐步稀释法，5-脱氧-β-D-核糖定量限、检测限浓度分别为0.005 5 mg/ml 和0.003 7 mg/ml，相当于样品中含量分别为0.027%和0.018%；D-核糖定量限、检测限浓度分别为0.006 1 mg/ml 和0.004 0 mg/ml，相当于样品中含量分别为0.031%和0.020%。5-脱氧-β-D-核糖在定量限水平精密度为 2.7%（n=6），D-核糖的精密度为 2.4%（n=6）。

2.6 线性关系试验 精密量取上述“2.2.1”项下的杂质贮备液 4、2、1.6、1 和 0.6 ml 分别置 10 ml 量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，按照“2.1”项下色谱条件进行试验，记录色谱图。以峰面积（Y）对浓度（X）进行线性回归分析，得出线性方程。结果表明，5-脱氧-β-D-核糖在5.4～36.3 μg/ml 浓度范围内与其峰面积呈良好的线性关系，线性方程为Y=9.642 5 X+19.403 7（r=0.999 2，n=5）。D-核糖在 6.1～40.4 μg/ml 浓度范围内与其峰面积呈良好的线性关系，线性方程为Y=14.449 2 X-7.782 7（r=0.999 0，n=5）。

2.7 精密度试验 按照“2.2.1”项下方法制备对照品溶液，连续进样 6 针，5-脱氧-β-D-核糖与D-核糖峰面积 RSD 分别为3.3%和 2.4%。

2.8 重复性试验 取同一批（批号20180429）样品，按照“2.2.2”项下方法制备 6 份供试品溶液，并按“2.1”项下色谱条件进样测定，结果均未检出5-脱氧-β-D-核糖和D-核糖。

2.9 溶液稳定性试验 取对照品溶液和“2.10”项下的100%回收率1#样品溶液，在室温分别放置 0、4、8、16 和 24 h，按“2.1”项下色谱条件测定，结果表明对照溶液和样品溶液在24 h 内基本稳定，对照溶液中，5-脱氧-β-D-核糖的 RSD 为 2.5%，D-核糖的 RSD为2.1%；样品溶液中5-脱氧-β-D-核糖的RSD 为2.0%，D-核糖的RSD 为1.7%。

2.10 加样回收率试验 称取样品（批号20180429）9份，每份约200 mg，精密称定置10 ml 量瓶中，精密加入“2.2.1”项下的杂质贮备液 3、2 和 0.6 ml，用流动相稀释至刻度，摇匀，分别作为150%、100%和定量限浓度水平回收率样品溶液，每种浓度制备3 份。分别进样，计算回收率，结果表明5-脱氧-β-D-核糖及D-核糖平均回收率分别为101.0%和100.2%，RSD 分别为2.9%和3.2%。在150%、100%及定量限水平回收率均符合规定。见表1 和表2。

表1 5-脱氧-β-D-核糖加样回收率试验结果

表2 D-核糖加样回收率试验结果

2.11 样品测定 取5 批1，2，3-三乙酰氧基-5-脱氧-β-D-核糖样品，按照“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，结果见表3。

表3 样品中有关物质含量测定结果

3 讨论

3.1 检测器选择 由于D-核糖与5-脱氧-β-D-核糖无紫外吸收，不适合使用紫外检测器方法，因此使用HPLC 示差折光检测器测定；示差折光检测器为通用型检测器，可以对两种杂质进行有效检测，故选择示差检测器为本试验色谱系统的检测器。

3.2 进样量的选择 示差折光检测器灵敏度比较低，且基线受温度、流动相组成影响较大，一般用于常量检测，较少用于痕量检测。本方法采用示差检测器检测5-脱氧-β-D-核糖与D-核糖线性浓度分别在5.4～36.3 μg/ml 和 6.1～40.4 μg/ml，经方法验证，进样量为100 μl 时，方可满足检测需求。

3.3 色谱柱的选择 本研究曾试用Waters Symmetry Shield RP-18 与Waters XBridge Amide 两种不同型号色谱柱，从分离度、峰形、响应值3 个方面考查。在Waters XBridge Amide 柱上分离度较好，峰形对称，故选用该色谱柱。

3.4 耐用性试验 对方法耐用性进行试验，通过改变流速［（1.0±0.1）ml/min］、柱温箱［（40±2）℃/min］、流动相比例（乙腈-水 72∶28 和 68∶32）等试验条件，考查色谱峰分离情况，结果各色谱峰之间分离良好。表明本试验方法的耐用性良好。