HPLC-ELSD 法测定心荣颗粒中黄芪甲苷的含量

张士妍，刘晓瑜，沈 倩

（无锡市药品安全检验检测中心，江苏 214028）

心荣颗粒是由黄芪、地黄、麦冬、五味子、赤芍及桂枝共6 味传统中药材经过提取、浓缩成一定密度的清膏后，与蔗糖、糊精等辅料制备而成的中药颗粒剂，因其具有助阳、益气、养阴等功效，被广泛用于心阳不振、气阴两虚型冠心病。黄芪作为该方君药，具有补气升阳，益肾活血等功效［1-3］。黄芪甲苷作为黄芪的主要活性成分，具有强心降压、抗心肌细胞缺氧缺血、改善新生血管、增强机体免疫功能等功效，心荣颗粒现行标准为国家食品药品监督管理局国家药品标准WS3-015（Z-015）-2005（Z），该标准未对黄芪甲苷含量进行控制，对药品质量体现不足。因此建立一种快速准确测定心荣颗粒中黄芪甲苷含量的方法，对心荣颗粒产品质量控制有重要意义［4-6］。

1 仪器与试药

1.1 主要仪器与设备 Agilent1260 高效液相色谱系统（Agilent Technologies Inc.）；蒸发光散射检测器（Agilent Technologies Inc.）；XPE56 电 子 天 平（METTLER TOLEDO）；XSE205 电子天平（METTLER TOLEDO）；Elmasonic 超声仪（Elma）；Millipore 超纯水机（美国Millipore 公司）。

1.2 主要试药 黄芪甲苷对照品（纯度96.9%，批号110781-201717，中国食品药品检定研究院）；心荣颗粒（安徽某制药有限公司，批号分别为200502、200602、200702，规格：10 g/袋）；心荣颗粒阴性对照（自制，缺黄芪）。乙腈（色谱纯，Merck），试验用水为超纯水（自制），甲醇、正丁醇等其他试剂均为分析纯（国药集团化学试剂有限公司）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱:Waters X-Bridge BEH Shield RP18 色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈-水（32∶68）；流速：1.0 ml/min；进样量：20 μl；蒸发光散射检测器，设置漂移管温度:70 ℃，载气流速:2.0 L/min。

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取15.294 mg 黄芪甲苷对照品，放置于20 ml 棕色量瓶中，缓慢加入10 ml甲醇轻轻振摇使其溶解，并且用甲醇定容至刻度，振摇至均匀，制得浓度为0.741 0 mg/ml 的黄芪甲苷对照品储备液。精密量取黄芪甲苷对照品储备液适量，稀释成浓度为0.370 5 mg/ml 的对照品溶液，即得到对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备 取10 袋供试品，将内容物混合均匀，然后研磨成粉末状，精密称取9.887 9 g，放置于100 ml 的具塞锥形瓶中，缓慢加入甲醇40 ml，盖紧瓶塞，轻轻振摇锥形瓶，使内容物完全被甲醇浸润，超声处理 30 min（200 W，40 kHz），待溶液冷却到室温后再滤过，将所得滤液用水浴缓缓加热浓缩至稠膏状，加温水10 ml，边加热边轻轻搅拌使浸膏溶解，使用正丁醇（水饱和）振摇提取，每次40 ml，共3 次；将提取液全部合并，用新制的氨试液充分洗涤4 次以去除酸性及弱酸性杂质，每次40 ml，将氨液全部弃去。在沸水浴上将洗涤后的正丁醇液蒸发近干，用适量的甲醇把残渣充分溶解，并且转移到5 ml 量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇至均匀，使用0.45 μm 滤膜进行过滤，取续滤液即为供试品溶液。

2.2.3 阴性样品溶液的制备 除黄芪外，取处方中的其余5 种中药材，制备阴性颗粒剂，按“2.2.2”项的方法制备成无黄芪的阴性样品溶液。

2.3 专属性试验 依照“2.1”项下色谱条件，分别精密量取对照品溶液、供试品溶液和阴性样品溶液各20 μl，依次进行色谱分析测定。结果显示黄芪甲苷峰形良好，主成分峰与杂质峰分离良好，供试品中杂质不干扰样品测定，在黄芪甲苷相应的保留时间处阴性样品溶液无色谱峰出现，表示无阴性干扰，见图1。

图1 对照品（A）供试品（B）阴性对照（C）HPLC 色谱图

2.4 线性范围试验 精密量取“2.2.1”项下黄芪甲苷对照品储备液适量，配制成浓度分别为0.370 5、0.185 2、0.092 6 和0.046 3 mg/ml 的溶液，将上述溶液与原浓度对照品储备液各精密量取20 μl，分别注入液相色谱仪，依照“2.1”项下色谱条件进行测定分析，记录黄芪甲苷峰面积，以对照品溶液浓度的对数（lgC）为横坐标，黄芪甲苷峰面积的对数（lgA）为纵坐标，进行线性回归分析，得到线性回归方程为：lgA=1.897lgC+3.850（r=0.999）。试验结果表明，在 0.046 3～0.741 0 mg/ml 范围内，黄芪甲苷浓度与峰面积取对数后呈良好的线性关系。

2.5 精密度试验 依照“2.1”项下应用的色谱条件，精密量取黄芪甲苷对照品溶液（0.370 5 mg/ml）20 μl，进行色谱分析测定，重复进样6 次，记录色谱图。黄芪甲苷峰面积相对标准偏差（RSD）为1.56%。试验结果表明，仪器精密度良好，能满足试验要求。

2.6 重复性试验 精密称取同一批号样品6 份（批号为200702），依照“2.2.2”项下的试验方法平行制备供试品溶液，依照“2.1”项下应用的色谱条件进行测定分析，记录主成分峰峰面积，分析检测重复性。根据“2.4”项下所得标准曲线，计算黄芪甲苷含量。结果表明，平均含量为 0.154 9 mg/g，RSD 为 1.08%，本试验方法测定黄芪甲苷的含量重复性较好。

2.7 稳定性试验 取本品内容物一份，精密称定，依照“2.2.2”项下的试验方法制备供试品溶液，依照“2.1”项下应用的色谱条件，于 0、2、4、6、8 和 12 h 分别进行测定分析，记录主成分峰峰面积，分析黄芪甲苷稳定性。结果表明，黄芪甲苷在12 h 内峰面积RSD为0.39%，稳定性良好。

2.8 加样回收率试验 精密称取6 份供试品（已知含量），分别加入浓度为0.741 0 mg/ml 的黄芪甲苷对照品储备液2 ml，依照“2.2.2”项下的试验方法制成供试品溶液，依照“2.1”项下应用的色谱条件进行分析测定，计算回收率。结果表明，平均回收率为97.60%，RSD 为1.04%（n=6）。该试验方法准确可靠，可用于心荣颗粒中黄芪甲苷的含量测定。见表1。

表1 黄芪甲苷回收率试验结果（n=6）

2.9 样品含量测定 取3 批样品，依照“2.2.2”项下的试验方法制成供试品溶液，依照“2.1”项下应用的色谱条件进行分析测定，记录主成分峰峰面积，并计算黄芪甲苷含量。批号为200502、200602、200702 的心荣颗粒，黄芪甲苷检测结果分别为1.542 5、1.520 3和1.502 5 mg/袋。见表2。

表2 心荣颗粒样品中黄芪甲苷的含量测定结果

3 讨论

3.1 测定黄芪甲苷方法的选择 近年来，对黄芪甲苷含量主要通过TLCS 法、HPLC-UV 法或HPLCELSD 法［7］进行测定。TLCS 法易受薄层板条件等多种外界因素影响、且操作步骤繁杂、重现性差。因黄芪甲苷最大紫外吸收波长仅在200 nm 附近，不适用于HPLC-UV 法准确测定黄芪甲苷含量［8］。而 HPLC-ELSD法准确度高、重现性好，常应用于如人参皂苷、黄芪甲苷等紫外吸收较弱的天然皂苷类活性物质。结合查阅相关文献资料［9-12］，本文采用 HPLC-ELSD 法测定心荣颗粒中黄芪甲苷含量，可为心荣颗粒中黄芪甲苷的测定提供可靠参考。

3.2 提取方式及时间的选择 前期试验显示，将供试品进行加热回流提取3 h 与超声提取30 min 黄芪甲苷含量无明显区别，超声提取相比于加热回流提取，时间短，效率高、节能环保，还对超声处理时间进行了考查，超声提取30、45 与60 min 效果相当，所以确定超声处理30 min 为供试品溶液的处理方法。

3.3 纯化方式的选择 预试验比较了将供试品在正丁醇液蒸干后，残渣加水溶解并通过大孔吸附树脂柱进行净化，洗脱液蒸干，残渣用甲醇溶解定容后再进样与正丁醇液残渣直接用甲醇溶解定容后进样的效果，结果表明，本检测方法省去大孔吸附树脂净化步骤，黄芪甲苷峰的分离度及检测仍可满足要求。

3.4 流动相的选择 HPLC-ELSD 法所采用流动相一般为乙腈-水或者甲醇-水系统。预试验中，本文分别采用不同配比的乙腈-水系统和甲醇-水系统作为流动相，进行多次筛选，经考查比较，乙腈-水（32∶68）为流动相，流速为1.0 ml/min 时，供试品溶液中黄芪甲苷出峰时间适中、峰形理想、与相邻杂质峰分离度良好，专属性好。

3.5 载气流速和漂移管温度的选择 采用ELSD 检测器时，检测结果会受到载气流速和漂移管温度的影响，不同的流速将会影响峰面积和保留时间；不同的漂移管温度将会影响基线的稳定性［13-14］。文献中多采用较高的载气流速与漂移管温度进行黄芪甲苷的测定［15-16］。经过多次优化，确定载气流速为2.0 L/min，漂移管温度为70 ℃时峰形良好无干扰，为最佳色谱条件。

黄芪甲苷为心荣颗粒的有效成分，但目前未见有关心荣颗粒中黄芪甲苷的有效测定方法的报道。试验证明，本研究采用HPLC-ELSD 法测定心荣颗粒中黄芪甲苷的含量，黄芪甲苷可与其他成分有效分离，测定结果重复性好，测定方法简单，高效，节能环保，可作为评价该药品中黄芪质量的有效方法。