炉甘石氧化锌洗剂微生物限度检查法的建立

李锦妹，林颖苹，陈文静，梁俊昌，朱文娟

1.惠州市食品药品检验所，广东 惠州 516003；2.惠州市皮肤病防治研究所，广东 惠州 516001

炉甘石氧化锌洗剂主要成分为炉甘石粉、氧化锌、苯酚、薄荷脑等，具有抑菌、杀菌、止痒作用，在治疗皮肤瘙痒、溃疡和红肿方面有良好的效果。文献报道，炉甘石、氧化锌、苯酚、薄荷脑等，对细菌、霉菌以及金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌均有不同程度的抑制作用［1-4］。若用常规法对其进行微生物限度检查，结果并不能真实反映样品的污染情况［5］。为此，根据《中国药典》2020 年版四部1105 和1106 的标准和方法［6］，对炉甘石氧化锌洗剂进行方法适用性试验，消除本品的抑菌性，从而准确有效地检出样品中污染的微生物。实验结果表明，采用对供试液静置3 min 后取上清的平皿法，对本品进行微生物限度检查，回收比值均在0.5～2范围内，说明方法可行［7］。该方法不需使用复杂的仪器设备，具有简便、快捷、准确、可行的优点，能真实反映炉甘石氧化锌洗剂的微生物污染水平，可有效控制该类药品的质量，并为其他含抑菌性不溶性粉末的液体药品的微生物限度检查法提供科学的实验依据。

1 仪器与试药

1.1 主要仪器

数显鼓风干燥箱（JC 1013A，南通嘉诚仪器有限公司）；立式自动压力蒸汽灭菌器（GR85DP，厦门致微）；生化培养箱（LRH-250，上海一恒科学仪器有限公司）；霉菌培养箱（MJX-250B Ⅲ，天津泰斯特）；生物安全柜（BS-1600，苏州安泰空气技术有限公司）。

1.2 菌种

金黄色葡萄球菌［CMCC（B）26003］、铜绿假单胞菌［CMCC（B）10104］、枯草芽孢杆菌［CMCC（B）63501］、白色念珠菌［CMCC（F）98001］、黑曲霉［CMCC（F）98003］，均购自北京三药科技开发公司。

1.3 培养基

沙氏葡萄糖琼脂培养基（SDA）、沙氏葡萄糖液体培养基（SDB）、胰酪大豆胨琼脂培养基（TSA）、甘露醇氯化钠琼脂培养基，购自北京陆桥技术股份有限公司；胰酪大豆胨液体培养基（TSB）和溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基购自广东环凯微生物科技有限公司。以上培养基适用性检查结果符合《中国药典》2020 年版四部规定［8］，并按其使用说明配制。

1.4 试剂

稀释液、冲洗液：pH 7.0 氯化钠-蛋白胨缓冲液（北京陆桥技术股份有限公司）；洗脱液：含0.05%（v/v）聚山梨酯80 的0.9%氯化钠溶液。

1.5 供试品

炉甘石氧化锌洗剂（批号：202106221，202106222，202106223），惠州市皮肤病防治研究所。

2 方法与结果

2.1 菌液制备［6］

2.1.1金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌将3 代试验菌接种至TSB 中，置32.5 ℃培养24 h；取TSB 培养液用0.9%无菌氯化钠溶液分别制成每1 mL 含菌数约为104cfu、102cfu 的菌悬液。

2.1.2白色念珠菌将3 代白色念珠菌接种至SDB中，置32.5 ℃培养24 h；取SDB 培养液用0.9%无菌氯化钠溶液分别制成每1 mL 含菌数约为104cfu的菌悬液。

2.1.3黑曲霉将3 代黑曲霉接种至SDA 斜面培养基中，置22.5 ℃培养7 d，用10 mL 洗脱液，将孢子洗脱，然后用无菌吸管吸出孢子悬液至无菌试管内，再用洗脱液制成每1 mL 含菌数约为104cfu 的黑曲霉孢子悬液。

2.2 供试液制备

分别取3 个批号供试品10 mL，加稀释液至100 mL，摇匀，制成1∶10 的供试液；依法制成1∶20、1∶30、1∶50 和1∶100 的供试液［9］。

2.3 方法学验证试验

需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数在用1 批次样品确定适合的检查方法后，验证试验至少应进行3次不同批次的平行试验，并分别计算各试验菌每次试验的回收比值，回收比值应在0.5～2 范围内。

2.3.1平皿法（1）试验组：取供试液各10 mL，分别置灭菌试管中，加入试验菌菌液（104cfu/mL）0.1 mL，振荡均匀，使供试液的含菌量在100 cfu/mL 以内，各吸取1 mL 至2 个平皿中，立即注入琼脂培养基（44 ℃）约20 mL，混匀，待凝固后，倒置培养；需氧菌总数平板置32.5 ℃培养3 d，霉菌和酵母菌总数平板置22.5 ℃培养5 d。（2）菌液对照组:取稀释液10 mL，分别置灭菌试管中，加入试验菌菌液（104cfu/mL）0.1 mL，振荡均匀，使供试液的含菌量在100 cfu/mL 以内，各吸取1 mL 置2 个平皿中，立即注入琼脂培养基（44 ℃）约20 mL，混匀，待凝固后，倒置培养。（3）供试品对照组：取上述供试液10 mL，以稀释液代替菌液同试验组操作，测定供试品对照组的平均菌落数。

2.3.2薄膜过滤法（1）试验组：取供试液各10 mL，分别置灭菌试管中，加入试验菌菌液（104cfu/mL）0.1 mL，振荡均匀，使供试液的含菌量在100 cfu/mL 以内，吸取1 mL 加至含100 mL 冲洗液的一次性无菌薄膜过滤器中，混匀，过滤，取滤膜菌面朝上贴于相应的琼脂培养基平板上。各试验菌平行制备2 张滤膜。（2）菌液对照组：取1 mL 试验菌菌液（102cfu/mL）加至含100 mL 冲洗液的一次性无菌薄膜过滤器中，混匀，过滤，取滤膜菌面朝上贴于相应的琼脂培养基平板上。各试验菌平行制备2张滤膜。（3）供试品对照组：取供试液1 mL，以稀释液代替菌液同试验组操作，测定供试品对照组的平均菌落数。

2.3.3平皿法（静置3 min）步骤同“2.3.1 平皿法”，试验组在加菌后，静置3 min，取上清液作后续试验。

2.4 控制菌检查法的验证

2.4.1金黄色葡萄球菌的方法适用性试验取1∶10的供试液10 mL 及金黄色葡萄球菌菌悬液（102cfu/mL）1 mL，接入适宜体积TSB 中，于32.5 ℃培养24 h。取TSB 培养液划线接种于甘露醇氯化钠琼脂培养基平板上，于32.5 ℃培养24 h，观察结果。

2.4.2铜绿假单胞菌的方法适用性试验取1∶10 的供试液10 mL 及铜绿假单胞菌菌悬液（102cfu/mL）1 mL，接入适宜体积TSB 中，于32.5 ℃培养24 h。取TSB 培养液划线接种于溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基平板上，于32.5 ℃培养24 h，观察结果。

3 结果

3.1 平皿法

需氧菌总数采用平皿法（1∶100）不能完全消除炉甘石氧化锌洗剂对枯草芽孢杆菌的抑菌作用，回收比值仅为0.05；霉菌和酵母菌总数采用平皿法（1∶10），回收比值均不大于0.5，结果见表1。

表1 平皿法各试验菌株回收比值

3.2 薄膜过滤法

采用1∶20 的供试液、冲洗量为500 mL 的薄膜过滤法，枯草芽孢杆菌的回收比值只有0.01，未达到药典要求，结果见表2。

表2 薄膜过滤法3种菌株的回收比值

3.3 平皿法（静置3 min）

通过静置3 min 后，需氧菌总数采用平皿法（1∶30）、霉菌和酵母菌总数采用平皿法（1∶10），各菌株的回收比值均在0.5～2.0 之间，结果见表3。

表3 平皿法（静置3 min）各试验菌株回收比值

由此可见，静置3 min 后取上清液作为供试液，可消除炉甘石氧化锌洗剂对枯草芽孢杆菌的抑菌作用。因此，对供试液静置3 min 后取上清液，采用平皿法，进行需氧菌总数（1∶30）、霉菌和酵母菌总数（1∶10）的检查。

3.4 控制菌检查法的验证结果

本实验分别比较了采用静置3 min 吸取其上清液和未静置两组实验，结果见表4。

表4 金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的试验结果

供试液未静置时，增菌液需达到300 mL 以上，金黄色葡萄球菌才能生长。而供试液经过静置后，只要100 mL 的增菌液，金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌均生长良好。可见，对供试液静置3 min 后取上清液，可用常规法检查控制菌。

4 讨论

本品含有炉甘石、氧化锌、苯酚、薄荷脑等成分，有较强的抑菌作用。验证结果表明，本品对枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌有很强的抑制作用。药典收载的去除或灭活供试品抗菌活性的方法有增加稀释液或培养基体积、加入适宜的中和剂或灭活剂、薄膜过滤法，或几法联用［6,10］。实验发现，采用增加稀释液（1∶20）和薄膜过滤法（500 mL/膜）联用，枯草芽孢杆菌的回收比值仍不能达到0.5～2.0 之间。薄膜过滤法只去除了溶于水的苯酚和薄荷脑的抑菌性，但洗剂中大量不溶于水的炉甘石和氧化锌粉末依然残留在滤膜上，抑菌性并未完全消除。因此实验采用供试液静置3 min 后取上清液，需氧菌总数采用平皿法（1∶30）、霉菌和酵母菌总数采用平皿法（1∶10），各菌株的回收比值均在0.5～2.0 之间，满足药典要求。控制菌中的金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌检查采用供试品静置3 min 后取上清液，用常规法即可。本实验操作简单，不需要特殊仪器设备，只需静置供试液取其上清液和增加稀释液量即可很好地消除本品在试验条件下的抑菌作用，能很好地控制炉甘石氧化锌洗剂的质量，同时该法可为同类药品的微生物限度检查方法验证提供参考［11］。

查阅相关文献显示，可采用离心沉淀集菌法［3］，消除样品中抑菌作用，但本实验考虑该法操作步骤把控难度及实验时间耗时过长影响污染菌检出结果，同时在进行低速离心试验时，样品里的不溶性物质对样品中所含的微生物还具有一定的携带作用［12］，尤其当制剂中含有不溶性辅料时，其携带作用更强［13］。因此尝试在试验过程中采用静置吸取其上清液［14］的方法以消除抑菌作用。试验表明，静置处理可消除样品的抑菌性，但需要注意的是，静置时间需严格控制在一定时间内，时间过短，样品的抑菌成分不能完全下沉,抑菌作用不能完全消除，影响回收比值；时间过长，菌体由于自身下沉作用，上清液体中含菌量偏低，同样会影响回收比值，且导致样品中污染菌的实际检出结果偏低。