HPLC 法同时测定喉痛灵颗粒中绿原酸、木犀草苷、迷迭香酸、蒙花苷含量

2022-03-16古炳明黄惠琳

药品评价 2022年1期

古炳明，黄惠琳

1 梅州市食品药品监督检验所，广东梅州 514011；2 嘉应学院医学院，广东梅州 514011

喉痛灵颗粒由野菊花、板蓝根、荆芥穗和水牛角浓缩粉组成，有清热解毒、消炎利咽等功效，常用于治疗慢性咽喉炎、急性化脓性扁桃体炎、感冒咽喉发热、上呼吸道炎、疔疮等。目前该药的执行标准收载于《卫生部药品标准中药成方制剂》第五册，仅有性状与三个理化鉴别，无含量测定项目［1］。曾小平等曾以薄层色谱法对板蓝根和荆芥穗进行定性鉴别，用高效液相色谱法测定野菊花中蒙花苷的含量［2］。胡恩建立高效液相色谱法测定喉痛灵颗粒中腺苷的含量［3］，但上述研究均为单指标含量分析，单一指标难以真实反映中药的质量情况。野菊花、荆芥穗为方中投料量较大的药物，野菊花中含有绿原酸、蒙花苷、木犀草苷等活性成分，荆芥穗中则含迷迭香酸、木犀草苷等成分［4-6］。研究证实绿原酸、蒙花苷、木犀草苷、迷迭香酸均有一定的抗炎、抗氧化等作用［7-10］，对上述指标进行含量测定以反映方中野菊花及荆芥穗的投料情况；因此本研究旨在通过建立HPLC 法同时测定绿原酸、木犀草苷、迷迭香酸及蒙花苷四种活性成分的含量，以期加强对喉痛灵颗粒的质量控制。

1 仪器与试药

1.1 仪器

AB204-N 型万分之一电子分析天平（梅特勒-托利多公司）；Sartorius BP 211D 十万分之一电子分析天平（赛托利斯公司）；LC-20AT 型液相色谱仪（日本岛津公司）；ULUP-I-10T 型纯水/超纯水机（西安优普仪器设备有限公司）；KQ-250DE型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 试药

对照品绿原酸（批号：110753-201817，含量以96.8%计）；木犀草苷（批号：111720-201810，含量以93.5%计）；迷迭香酸（批号：111871-201706，含量以90.5%计）；蒙花苷（批号：111528-201710，含量以96.6%计）；均由中国食品药品检定研究院提供。喉痛灵颗粒：广西A 公司（批号：181001、190302、190204、190504），广州B 公司（批号：8341A04），河北C 公司（批号：04A181103）。色谱级甲醇（天津市四友精细化学品有限公司，批号：633379-05653），磷酸（天津市科密欧化学试剂有限公司，批号：20180520）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：CAPCELL PAK C18 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脱（0～30 min，7%～45% A；30～45 min，45%～80% A；45～55 min，7% A）；检测波长：334 nm；流速：0.8 mL/min；柱温：30 ℃；进样量为10 μL。

2.2 对照品储备液的制备

分别精密称取绿原酸对照品6.45 mg，木犀草苷对照品11.53 mg，迷迭香酸对照品11.44 mg，蒙花苷对照品4.96 mg，置20 mL 量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

2.3 混合对照品溶液的制备

分别精密吸取对照品储备液各1 mL，置同一10 mL 容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为混合对照品溶液。

2.4 供试品溶液的制备

取喉痛灵颗粒研细，取2.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，称定重量，超声处理30 min，放至室温，再次称重，以甲醇补充减失质量，取续滤液，作为供试品溶液。

2.5 阴性样品的制备

按喉痛灵颗粒处方，称取缺野菊花和荆芥穗的药材适量按其生产工艺，制成不含上述药材的阴性样品。按“2.4”项下供试品溶液的制备方法制成阴性样品溶液。

2.6 专属性试验

分别精密吸取混合对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液各10 μL，按“2.1”项下色谱条件测定。结果：供试品色谱图中绿原酸、木犀草苷、迷迭香酸和蒙花苷的色谱峰分离度良好，与对照品溶液色谱峰保留时间一致，理论塔板数均大于1×105，且阴性样品无干扰，见图1。

图1 混合对照品（A）、喉痛灵颗粒供试品（B）、缺野菊花和荆芥穗阴性样品（C）的HPLC图

2.7 线性关系考察

取“2.3”项下混合对照品溶液，分别进样1、2、5、10、15、20 μL，按“2.1”项下的色谱条件测定，测出其峰面积。以对照品进样质量（X）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标，进行线性回归分析，得回归方程及线性范围。结果见表1。

表1 4种成分的回归方程和线性范围（n=6）

2.8 精密度试验

取混合对照品溶液，连续进样6 针，记录各自的峰面积，根据峰面积计算得绿原酸、木犀草苷、迷迭香酸和蒙花苷峰面积的RSD 值分别为0.29%、0.32%、0.31%、0.24%。

2.9 重复性试验

取批号181001 喉痛灵颗粒样品6 份，制备供试品溶液，分别进样测定峰面积，计算得绿原酸、木犀草苷、迷迭香酸和蒙花苷含量的RSD 值分别为1.30%、1.14%、0.70%、0.98%。

2.10 稳定性试验

取批号181001 喉痛灵颗粒样品6 份，制备供试品溶液，在0、2、4、8、24 h 分别进样，记录各自的峰面积，计算得绿原酸、木犀草苷、迷迭香酸和蒙花苷峰面积RSD 值分别为1.00%、1.11%、1.01%、1.44%。

2.11 加样回收试验

取批号181001 喉痛灵颗粒样品6 份，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别加入混合对照品溶液（含绿原酸156.09 μg/mL，木犀草苷269.51 μg/mL，迷迭香酸254.27 μg/mL，蒙花苷119.78 μg/mL）1.0 mL，按“2.4”项下制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进行测定，计算绿原酸、木犀草苷、迷迭香酸和蒙花苷平均回收率分别为99.02%、100.12%、99.83%、98.95%，RSD 值分别为0.50%、0.32%、0.29%、1.34%，见表2。

表2 加样回收结果

2.12 样品测定

取6 批喉痛灵颗粒，分别制备供试品溶液，进样测定，根据标准曲线法计算各成分的含量，结果见表3。由表中数据可知，不同厂家间、同一个厂家不同批次产品中绿原酸、木犀草苷、迷迭香酸和蒙花苷的含量差异较大。

表3 样品测定结果

3 讨论

3.1 洗脱条件的建立

本研究曾参照梁健丽等［11］采用HPLC 法同时测定野菊花配方颗粒中绿原酸、咖啡酸和蒙花苷的方法，发现待测物对于洗脱溶液的梯度变化较敏感，经多次微调后最终确定了“2.1”项下的洗脱方式，但流速为1.0 mL/min 时木犀草苷与杂质峰分离度不足1.5，后将流速降低至0.8 mL/min 后分离度在1.5以上且各目标峰的峰形良好。

3.2 检测波长的选择

取对照品溶液，在200～400 nm 范围内进行DAD 全波长扫描分析，绿原酸在326 nm 处有最大吸收，木犀草苷在350 nm 处有最大吸收，迷迭香酸在329 nm 处有最大吸收，蒙花苷在334 nm 处有最大吸收，各目标物最大吸收波长相近且在334 nm处均有较大吸收，色谱峰尖锐且塔板数均在1×105以上，最终选定检测波长为334 nm。

3.3 含量结果分析

本研究测定了3 个厂家的6 个批次的喉痛灵颗粒，由表3 可知，3 个厂家的6 个批次样品均能测出绿原酸、木犀草苷、迷迭香酸、蒙花苷，且含量存在一定的差异。通过对比由广西A 公司生产的4个不同批次的喉痛灵颗粒，其中批号190204 中绿原酸、迷迭香酸、蒙花苷的含量较其他3 个批次的高，且蒙花苷的含量是批号190504 的近2 倍，说明喉痛灵颗粒不同厂家间、同一个厂家不同批次间绿原酸、迷迭香酸、蒙花苷含量差异较大，有必要通过制定标准以加强其质量控制。