HPLC 法测定大黄通便片5 种有效成分的含量

王爱贵，周丽红，谢作桦，陈琦，曾春芳，张思琼

1.江西德上制药股份有限公司，江西 樟树 331208；2.江西德上医药研究院有限公司，江西 樟树 331208；3.罗坊中心卫生院，江西 新余 338000

大黄是蓼科植物掌叶大黄Rheum palmatumL.、唐古特大黄Rheum tanguticumMaxim.ex Balf.或药用大黄Rheum officinaleBaill.的干燥根和根茎［1-2］。具有泻下攻积，清热泻火，凉血解毒，逐瘀通经，利湿退黄之功效［3］；主要含有蒽醌类、多糖类和鞣质；在调节胃肠功能、抗病原微生物、抗肿瘤，保护心脑血管、肝及抗衰老等方面具有显著功效，正成为研究热点。其中蒽醌类成分药理作用主要应用于调节胃肠功能，如大黄素、大黄酚、芦荟大黄素、大黄素甲醚、大黄酸等，抗病原微生物主要成分有3-羧基大黄酸、羟基芦荟大黄素、羟基大黄素等。近年来国内外对大黄进行了大量的研究，其药理作用不断被认识，临床应用范围逐步扩大，加之人们对中医药的不断认可，大黄临床使用量逐年加大［4-5］。大黄炮制饮片具有不同功效，酒大黄善清上焦血分热毒，用于目赤咽肿、齿龈肿痛。熟大黄泻下力缓、泻火解毒，用于火毒疮疡。大黄炭凉血化瘀止血，用于血热有瘀出血症［6］。大黄通便片为江西德上制药股份有限公司独家生产品种，单处方，主要成分为大黄，主要用于患者清实热，临床应用于湿热型造成的食欲不振及便秘［7］。目前，对大黄通便片的指标性成分含量测定主要集中在大黄素和大黄酚上，本试验采用HPLC 法同时测定大黄通便片中芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚5 种有效成分的总含量，以期为该产品的质量控制提供有效手段。

1 材料

1.1 仪器

LC-20AT 高效液相色谱仪（日本岛津公司）；LE204E 电子天平［梅特勒托利多仪器（上海）有限公司］；MS105DU 精度电子天平［梅特勒托利多仪器（上海）有限公司］；HH-4数显恒温水浴锅（上海江星仪器有限公司）；QTSXR20500 数控超声波清洗仪（天津市瑞普电子仪器公司）；AXLK1810-1 超纯水机（重庆阿修罗科技发展有限公司）。

1.2 试剂

芦荟大黄素（批号110795-202011，纯度97.5%）；大黄酸（批号110757-201607，纯度99.3%）；大黄素（批号110756-201913，96.0%）；大黄酚（批号110796-201922，纯度99.4%）；大黄素甲醚（批号110758-201817，纯度99.2%）；均来源于中国食品药品检定研究院。甲醇为色谱纯（国药集团化学试剂有限公司）。其他试剂为分析纯，来源于西陇科学股份有限公司；水为超纯水。

1.3 药品

大黄通便片共6 批，由江西德上制药股份有限公司提供。批号分别为：20080201、20090201、20100203、20050202、21020202、21100202。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

C18 色谱柱（岛津GL Sciences，250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为甲醇-0.1%磷酸溶液（85∶15）；流速1.0 mL/min；柱温30 ℃；检测波长254 nm；进样量20 μL。

2.2 溶液制备

2.2.1对照品溶液分别取经五氧化二磷减压干燥24 h 的芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚5 种对照品适量，精密称定，制成每1 mL含5 种对照品成分各19.30、16.02、39.31、19.41、18.72 μg 的混合对照品溶液。

2.2.2供试品溶液 取大黄通便片(批号21020202）20 片，除去包衣，研细，取3 g，精密称定，加入甲醇25 mL，称定重量，水浴回流30 min，取出，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过。精密移取续滤液5 mL，置50 mL 圆底烧瓶中，挥去甲醇，加2.5 mol/L 硫酸溶液10 mL，超声处理（功率120 W，频率59 kHz）5 min，再加三氯甲烷10 mL，加热回流1 h，冷却，移置分液漏斗中，用少量三氯甲烷洗涤容器，并入分液漏斗中，分取三氯甲烷层，酸液用三氯甲烷提取3 次，每次10 mL，合并三氯甲烷液，以适量无水硫酸钠脱水，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇使溶解，转移至25 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。

2.2.3阴性样品溶液［8］取处方比率的淀粉与硬脂酸粉混合物3 g，精密称定，其他同“2.2.2”制备方法，即得。

2.3 方法学考察［9］

2.3.1系统适用性考察取对照品、供试品、阴性样品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，结果可知，芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚峰与相邻色谱峰的分离度大于1.5，理论塔板数按大黄素计算不低于3 000［10］。

2.3.2 专属性试验分别进样20 μL 对照品溶液、供试品溶液和阴性样品溶液，记录色谱图，结果见图1，供试品、对照品溶液在相同保留时间上都有色谱峰，阴性样品的色图谱与对照品的色谱图比较，在芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚保留时间相应位置上无相应的色谱峰出现，说明阴性样品无干扰。

图1 大黄通便片各成分HPLC色谱图：A.阴性样品；B.混合对照品；C.供试品

2.3.3 精密度试验［11］精密吸取同一对照品溶液，在“2.1”项色谱条件下连续进样6 次，测得芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚峰面积RSD%分别为0.43%、0.54%、0.46%、0.42%、0.87%，表明精密度良好。

2.3.4重复性［12］取大黄通便片（批号：21020202），精密称定6 份，按“2.2.2”项下制备供试液，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，根据测定的样品色谱峰面积计算，平均每片大黄通便片中含有芦荟大黄素含量0.89 mg、大黄酸0.73 mg、大黄素1.09 mg、大黄酚4.35 mg、大黄素甲醚0.92 mg，RSD 分别为0.21%、0.06%、0.05%、0.25%、0.26%，表明重复性良好。

2.3.5线性范围考察［13］将“2.2.1”项下对照品溶液，在“2.1”项色谱条件下分别进样5、10、15、20、25 μL，以对照品质量浓度（mg/L）为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚回归方程。结果见表1，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

表1 各成分线性关系

2.3.6稳定性试验取同一批大黄通便片（批号21020202），按“2.2.2”制备供试品溶液，分别于0、2、4、6、12、24 h 在“2.1”项色谱条下进行测定，测得芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚峰面积RSD 分别为0.8%，1.2%，0.9%，1.3%，1.7%。测试结果表明，5 种主要活性成分在24 h 稳定性良好。

2.3.7 回收率试验 精密称量各成分含量已知的大黄通便片（批号21020202）9 份，分别按低、中、高水平加入适量对照品溶液，每个对照品浓度各加入3 份，按“2.2.2”制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，计算回收率。结果见表2。

表2 （续）

2.3.8样品含量测定分别取6 批大黄通便片适量，精密称定，按“2.2.2”项下制备供试液，在“2.1”项色谱条件下分别精密吸取上述各供试液20 μL，注入液相色谱仪，测定各色谱峰峰面积，根据外标法计算含量。结果见表3。

表3 大黄通便片含量测定结果（mg/片）

3 讨论

3.1 供试品溶液制备方法筛选

考察了甲醇、水、50%甲醇，发现以水作为提取溶剂时，各成分含量低；以甲醇提取时，各成分提取效果最佳，因此，选择甲醇作为提取溶剂。

考察了超声、加热回流、冷浸三种提取方式，发现加热回流提取效果较好，冷浸效果最差。最终选择加热回流的提取方法。

3.2 色谱条件筛选

3.2.1色谱柱考察了月旭两种不同货号（00215-31043、00260-31043）色谱柱,两个不同货号的月旭色谱柱分离效果均最好，重复性理想。

3.2.2 检测波长将对照品、样品在190～800 nm 范围内进行全波长扫描，发现各成分在254 nm 处均有较大吸收峰,而且干扰较小，基线平稳。因此，选择254 nm 作为检测波长［14］。

4 结论

大黄通便片中添加的辅料有淀粉、硬脂酸镁等，结果证明，添加的辅料对药品中5 个主要成分的含量测定无影响。

使用甲醇作为溶剂，水浴回流提取，挥干后加硫酸溶液与三氯甲烷，继续回流提取，以甲醇-0.1%磷酸溶液（85∶15）为流动相，建立了高效液相法测定大黄通便片中5 种有效成分的含量，方法分离度高，峰形较好，溶剂干扰较小，能在30 min 内完成所有目标峰的测定。

本实验建立了HPLC 法同时测定大黄通便中芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚含量，该方法操作简便，重复性好，准确度高，可为该制剂的质量控制提供参考。