钙激活钾通道在烟雾暴露所致大鼠血压升高中的作用

刘燕锋，王凤晓，阮冬云，唐昱，张学洪，王云霞

1.江西省人民医院，南昌大学附属人民医院，江西 南昌 330006；2.江西省第五人民医院，江西 南昌 330046

吸烟是影响健康的一大危害因素，与心血管疾病的发生发展有着密切的联系。吸烟可导致血管平滑肌（vascular smooth muscle，VSM）的损伤［1］，血管平滑肌损伤进一步导致血管功能紊乱。大电导钙激活钾通道（large-conductance calcium-activated potassium channels，BK 通道）广泛分布于血管平滑肌细胞上，在血管舒缩功能调节方面起着重要作用［2-3］。本研究选取大鼠血管平滑肌细胞作为研究对象，探讨吸烟对动脉血管平滑肌细胞及其BK 通道电流的影响，对吸烟引起血压升高的具体机制进行深入的探讨。

1 材料和方法

1.1 实验动物

雄性Wistar 大鼠48 只，体质量200±20 g，购于医科院动物所，动物合格证号0123009，饲养于清洁级动物房。

1.2 实验器材及试剂

1.2.1实验仪器小动物恒温系统，小动物无创血压测量系统（上海奥尔科特生物科技有限公司），倒置荧光显微镜，膜片钳放大器（Axopatch 200B）及DigiData 1200B 型数/模（或模/数）转换器（Axon，美国），03-D 玻璃微电极拉制仪。

1.2.2实验试剂透明质酸酶、胶原酶、二硫苏糖醇、木瓜蛋白酶、牛血清白蛋白（Sigma，美国）；乙二醇二乙醚二胺四乙酸、N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙烷磺酸（Germany），余试剂均为国产分析纯。酶液Ⅰ：木瓜蛋白酶，1.75 mg/mL；二硫苏糖醇，1.75 mg/mL；白蛋白，2.5 mg/mL。酶液Ⅱ：胶原酶Ⅰ，2.5 mg/mL；透明质酸酶，2.5 mg/mL；白蛋白，2.5 mg/mL。电极内液：KCl，40 mmol/L；K2Asp（天门冬氨酸钾），100 mmol/L；MgCl2，1 mmol/L；EGTA，0.1 mmol/L；ATPNa2，4 mmol/L；HEPES（N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙烷磺酸），10 mmol/L。电极外液：NaCl，134 mmol/L；KCl，6 mmol/L；MgCl2，1 mmol/L；CaCl2，2 mmol/L；HEPES，10 mmol/L；葡萄糖，10 mmol/L。

1.3 大鼠模型建立与分组

烟雾暴露动物模型的建立：雄性Wistar 大鼠48只，按随机数字表法分为对照组、烟雾暴露组，每组24 只，根据烟雾暴露时间，各组每个时间点6只大鼠。烟雾暴露组大鼠置于实验性大鼠被动吸烟箱内进行模型制作，方案为：每天在特定时间使大鼠接受烟雾暴露1 次，每次暴露于10 支香烟的烟雾中，每次点燃2 支香烟，共分5 次点燃。香烟为市面上常规出售的香烟，焦油含量为13 mg/支，尼古丁含量为1.2 mg/支，分别烟雾暴露0、4、8、12 周，对照组除不进行烟雾暴露之外，其余处理相同。血压测定采用无创血压测量分析系统，每天于8:00-14:00 测定大鼠血压水平，每只大鼠在安静状态下测血压3 次，取平均值。烟雾暴露组大鼠血压从第6 周开始升高，第12 周烟雾暴露组大鼠血压较对照组血压值增加40 mm Hg 以上，表明大鼠烟雾暴露所致高血压模型的建立成功。

1.4 血压测量方法

将大鼠尾动脉测压仪开启预热20 min，进行大鼠血压信号标测。据大鼠体量将其装入固定盒内固定后，尾部插入加压套近尾根部,使鼠尾刚好处于脉搏传感器的“脉搏信号传感片”上方，使鼠尾压迫传感片紧贴尾动脉,待大鼠脉搏稳定后进行血压测量。

1.5 主动脉形态学检测

以肝素抗凝，戊巴比妥钠麻醉后，将大鼠断头处死，取出主动脉，于主动脉弓处选取血管组织，置入4%多聚甲醛中固定24 h，随后行石蜡包埋，切片，HE 染色。光镜下观察对照组及烟雾暴露12周时大鼠血管形态变化。

1.6 大鼠主动脉血管平滑肌细胞的分离

在实验第0、4、8、12 周，分离大鼠主动脉平滑肌细胞：戊巴比妥钠麻醉大鼠，取出胸主动脉,游离出血管中膜，依次放入酶液Ⅰ、酶液Ⅱ中进行消化，酶液I 消化时间为25 min，酶液Ⅱ为15 min，高倍镜下观察细胞悬液，每个视野可找到4～5 个膜完整且折光性好细胞，即可终止酶解，将细胞悬液放置于4 ℃冰箱保存。

1.7 膜片钳全细胞BK 电流记录方法

采用垂直玻璃微电极拉制仪两步法拉制玻璃微电极，电极尖端阻抗4～7 MΩ,电极经拉制抛光后入液电阻4～7 MΩ,封接电阻＞1 GΩ，内充电极内液，NaOH 调pH 值至7.4。将分离出的VSMC 保存于无钙台氏液中，细胞悬液加于灌流槽中，待细胞贴壁后，电极外液1～2 mL/min 灌流15～20 min。电极入液，钳制平滑肌细胞，负压破膜，使细胞内液与电极内液完全相通，建立全细胞记录后，使用pCLAMP 软件（pCLAMP 9.0，Axon Instruments，USA）记录细胞膜电容（Cm），随后以放大器（Axopatch 200B，AxonInstruments，USA）的慢电容补偿和串联电阻补偿，保持钳制电位为-60 mV，给细胞施加去极化方法刺激，频率0.2 Hz，持续时间为400 ms，从-50 mV 去极化至+70 mV，以激发外向钾电流,观察到电流基本稳定后，记录电流。电流记录在室温条件（25 ℃）下进行。

1.8 统计学方法

以SPSS 17.0 软件进行统计分析，采用重复资料测量的方差分析方法来分析大鼠血压随时间的变化趋势，采用pCLAMP 9.0 软件对膜片钳记录数据进行数据和图形转换，计量资料以表示，行t检验，P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 烟雾暴露对大鼠血压的影响

本实验通过建立烟雾暴露动物模型，观察烟雾暴露对大鼠血压的影响。实验结果表明（见图1），烟雾暴露组第8～12 周血压，较对照组明显增高（P＜0.05）。

图1 烟雾暴露对大鼠血压的影响（n=6）

2.2 血管形态学变化

显微镜下可见对照组大鼠主动脉内皮完整，中膜平滑肌细胞排列规则（图2-A）。烟雾暴露组大鼠主动脉壁增厚，内皮细胞下基质变厚，中膜的平滑肌层增厚，平滑肌细胞整体变短小（图2-B），提示烟雾暴露使动脉平滑肌增生。

图2 大鼠主动脉血管结构的光镜观察（HE×100倍）：A.对照组；B.烟雾暴露组

2.3 烟雾暴露对大鼠平滑肌细胞BK 通道电流密度的影响

在全细胞模式下，将膜电位钳制在-60 mv，阶跃刺激从-50 mv 开始，以10 mv 阶跃去极化至+70 mv，持续400 ms，诱发出大鼠主动脉平滑肌细胞BK 电流（见图3）。在实验第0、4、8、12 周，使用全细胞膜片钳记录对照组及烟雾暴露组大鼠主动脉平滑肌细胞钙激活钾通道电流密度，烟雾暴露组BK 通道电流密度随着烟雾暴露持续时间的增加而逐渐减低，对照组BK 通道电流密度无明显变化。

图3 烟雾暴露时间与大鼠平滑肌细胞膜BK通道电流密度的关系（n=6）

2.4 BK 电流密度-电压（I/V）曲线测定

电压钳模式下，将膜电位钳制在-60 mV，阶跃刺激从-50 mV 开始，以10 mV 阶跃去极化至+70 mV，持续400 ms，根据激活电位及相应的电流密度可得到I/V 曲线图（图4）。烟雾暴露组大鼠BK 通道电流密度在不同的时间点（0、4、8、12 周），不同的刺激电压，电流变化的趋势也不同（P＜0.05）。

图4 大鼠主动脉平滑肌细胞BK电流密度-电压（I/V）曲线（n=6）

3 讨论

吸烟是导致血管相关疾病的重要原因之一，烟草烟雾中的有害物质可造成血管舒缩功能异常［4］。以往关于吸烟对血管功能影响的研究，多集中于血管内皮功能［5-6］。本实验建立烟雾暴露大鼠模型，探讨烟草烟雾暴露对大鼠血管平滑肌功能的直接影响。在我们的实验中观察到，烟雾暴露12 周，大鼠血管壁出现局部增厚，内皮细胞出现部分基质变厚，平滑肌层增厚，提示烟雾暴露会导致血管平滑肌增生。有研究表明，血管平滑肌细胞增殖可以影响大鼠血压水平［7］。同时，我们监测大鼠血压发现，第6 周开始，烟雾暴露组大鼠的血压水平开始升高，并随着烟雾暴露时间的延长而持续升高，提示烟雾暴露可能通过调节血管平滑肌舒缩功能而影响大鼠血压水平。

血管平滑肌细胞在调节血管舒缩状态中起到决定性的作用。在动脉平滑肌细胞膜上，BK 通道对血管舒缩功能的调节作用最为重要［8-9］。研究表明大鼠在长期寒冷刺激的环境下，胸主动脉平滑肌细胞BK 通道的活性下降［10-11］。BK 通道改变会直接影响血管张力。细胞内钙离子浓度升高时，BK 通道被激活，产生钾离子外流，从而导致细胞超极化，反馈性地抑制钙离子通道开放，从而使血管扩张［12］。使用BK 通道特异性阻滞剂Iberiotoxin 阻滞BK 电流后，动脉明显收缩，因此BK 通道对动脉血管张力也具有重要的调节作用［13］，烟草烟雾所致的血管张力及血压水平的变化是否是导致血管平滑肌细胞BK 通道电流改变的结果尚不清楚。

有报道提出，烟雾暴露可以通过激活电压依赖性Ca2+通道及诱导肌浆网内Ca2+释放，增加细胞内Ca2+的浓度［14］，当细胞内Ca2+浓度升高时导致BK 通道开放，形成自发性一过性K+外流，引起细胞超极化使血管扩张，从而使肌张力尽量维持在一定水平［15］。在实验中，我们观察到烟雾暴露组大鼠血管平滑肌细胞钙离子钾通道电流及电流密度从第4 周时开始减低，且随着烟雾暴露的时间延长而持续降低，同时血压持续上升。结果表明，在长期烟雾暴露的条件下，血管平滑肌细胞BK 通道功能受损，对血管舒缩功能的反馈性调节作用减弱，从而使血压随烟雾暴露时间的延长而持续升高。

本实验研究结果表明，烟雾暴露时，血管平滑肌细胞增殖，细胞内钙离子浓度随烟雾暴露时间的延长而升高，从而导致机体血压的升高；而BK Ca2+通道电流作为一种调节血管舒张的反馈性的保护因素，随烟雾暴露时间的延长而减低，血管舒缩功能障碍，进一步导致机体血压升高。因此，在吸烟人群中，尽量阻断或者减少香烟毒素对血管平滑肌BK的损伤，可能有助于降低吸烟人群高血压的发病率，为吸烟人群心血管并发症的防治提供了新的思路。