淫羊藿治疗阿尔茨海默病作用机制的网络药理学与分子对接研究

梁建文，王晋平，谢荣鑫，刘宗鑫，欧阳燕玲

1.广西中医药大学第一临床医学院(广西 南宁 530000)

2.广西中医药大学第一附属医院脑病科(广西 南宁 530000)

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一种以进行性认知障碍为特征的中枢系统退行性疾病，占总痴呆患者的50%～75%[1]，其特征是大脑中积累淀粉样蛋白(Aβ)斑块和神经纤维缠结。据预测，2030、2040、2050年中国60岁以上老年患病人数分别可达到2 075万、2 687万、3 003万[2]。AD发病机制复杂，既与胆碱能缺乏、氧化应激、炎性损伤等有关，也与环境因素、教育程度等有关[3-4]。淫羊藿是临床常用中药，具有补肾阳、强筋骨的功效，用于肾阳亏虚所致善忘痴呆、阳痿遗精等。其主要成分为黄酮类、淫羊藿苷等，具有抑制破骨细胞、增强免疫功能、抗衰老等药理作用。网络药理学是对生物系统的网络分析，通过选取特定节点进行多靶点药物分子设计[5]。网络药理学强调对信号通路的多途径调节，提高药物的治疗效果，降低毒副作用，从而提高新药临床试验的成功率，降低药物的研发费用。目前已被广泛应用于中药研究。分子对接是分子与分子间的空间和能量识别[6]。空间匹配说明分子间存在相互作用可能性，而能量匹配说明分子间具有保持结构稳定的可能性。通过分子对接技术，可预测配体和受体是否存在相互作用。因此，分子对接的方法是现代信息技术用于药物研究的一项重要技术。本文基于网络药理学从有效成分和靶点、靶点互作网络、基因本体(GO)和京都基因与基因组(KEGG)分析、分子对接等方面探讨淫羊藿治疗AD潜在机制。

1 材料与方法

1.1筛选淫羊藿中有效成分和靶点通过中药系统药理学数据库及分析平台[7](TCMSP)(表1)，以“淫羊藿”检索全部活性成分，以口服生物利用度(OB≥30%)、药物类药性(DL≥0.18)、血脑屏障(BBB≥-0.3)为筛选条件[7]，筛选淫羊藿有效成分和相关靶点。

表1 本研究所使用的数据库和软件

1.2筛选淫羊藿治疗AD的直接调节靶点通过UniProt数据库检索出靶点的基因名并注释(排除物种为非人类的基因)；以关键词“Alzheimer’s disease”检索GeneCards数据库，得到AD疾病总靶点基因；通过R语言将AD疾病相关靶点基因与淫羊藿靶点基因取交集，得到淫羊藿和AD疾病共同靶点基因，即淫羊藿治疗AD的直接调节靶点。

1.3构建中药-疾病靶点PPI互作网络和中药-成分-靶点-疾病调控网络①将有效成分与淫羊藿-AD靶点基因导入Cytoscape 3.82版软件[8]，构建中药-成分-靶点-疾病调控网络图。②将淫羊藿-AD靶点基因导入STRING数据库，构建PPI网络互作图。

1.4筛选核心靶点运用CytoNCA插件对PPI网络进行拓扑计算，通过取点度中心性(Degree)、接近中心性(Closeness)、中介中心性(Betweeness)中位数(即Degree>10.5，Closeness>0.442，Betweeness>31.5)筛选淫羊藿-AD核心靶点。

1.5GO功能分析和KEGG通路分析运用DAVID数据库进行GO和KEGG富集分析，利用R语言软件将数据进行可视化，得到GO功能分析条形图和KEGG通路富集分析气泡图。

1.6分子对接根据自由度大小，选取有效成分与核心靶点，通过Chem3D、Pymol、AutoDock和Vina软件进行分子对接，得到其结合能大小和氢键数目。

2 结果

2.1淫羊藿中有效成分的筛选和靶点结果TCMSP数据库中得到总活性成分130个，根据OB(≥30%)、DL(≥0.18)和BBB(≥-0.3)(保留小数点后两位)标准对淫羊藿的总活性成分进行筛选，结果得到有效成分11种(表2)，与有效成分的相关靶点共149个，去重后得到74种。

表2 淫羊藿中的有效成分

2.2中药-疾病靶点构建的结果利用R语言软件将AD总靶点与淫羊藿有效成分相关靶点取交集，得到中药-疾病共同靶点的韦恩图(图1)。AD总靶点11 032种，淫羊藿有效成分相关靶点74种，交集结果得到中药-疾病共同靶点62种。

药物：74种淫羊藿有效成分相关靶点；疾病：11 032种阿尔茨海默病总靶点；棕色：62种淫羊藿-AD共同靶点。

2.3构建中药-成分-靶点-疾病调控网络的结果中药-成分-靶点-疾病网络图(见图2)，矩形大小与自由度呈正相关，提示自由度前3名分别为2,7-二氢高刺桐春、去水淫羊藿和8-(3-甲基丁-2-烯基)-2-苯基色酮，说明这3种成分含蛋白靶点数量较其它成分多。橙色矩形部分为淫羊藿有效成分与AD共同靶点，共有62种，其颜色深浅与自由度呈正相关，提示自由度前3名为PTGS2、PTGS1和ESR1，说明这3种靶点存在于多种成分中。

绿色：淫羊藿；紫色：淫羊藿有效成分；橙色：淫羊藿有效成分与AD共同靶点；灰色：淫羊藿靶点与AD靶点无交集基因部分，蓝色：阿尔茨海默病。

2.4构建中药-疾病共同靶点蛋白相互作用网络与筛选核心靶点的结果构建PPI网络互作图(图3)，剔除2个没有网络的节点后，图中包含60个节点，313条边，涉及生物过程710种，分子功能130种，细胞成分53种，KEGG通路67条。每个节点的平均自由度为10.3。筛选核心靶点的结果(图4)所示，颜色深浅表示自由度大小，节点的形状大小表示接近中心性的大小，节点标签文字的大小表示中介中心性的大小。中药-疾病核心基因筛选出20个，Degree值排名前3的靶点依次为ACHE，SLC6A4，HTR3A，见表3。

表3 淫羊藿-AD核心靶点

图3 PPI网络互作图

注：颜色深浅与自由度呈正相关，节点形状大小与closeness值呈正相关，节点标签文字大小与betweenness值呈正相关。

2.5GO富集分析结果将20种核心靶点导入DAVID数据库[9]，得到GO分析结果。根据GO结果

上富集数量值的大小排列，从生物过程(BP)、细胞组成(CC)和分子功能(MF)中筛选前10位进行可视化分析(表4、图5)。淫羊藿治疗AD的生物过程主要涉及化学性信号转导、突触传递、药物反应、细胞增殖的负调控、细胞增殖的正调控、G蛋白偶联受体信号通路、腺苷酸环化酶激活肾上腺素能受体信号通路、ERK1和ERK2级联的正调节、平滑肌收缩调节等方面；分子功能主要涉及蛋白质结合、蛋白质同源二聚化活性、药物结合、血清素结合、肾上腺素结合、神经递质受体活性、G蛋白偶联5-羟色胺受体活性、蛋白质异二聚活性、α2肾上腺素能受体活性等方面；细胞组成主要涉及质膜、突触后膜、神经元细胞体、神经元投射等方面。

表4 GO分析结果

图5 GO富集分析

2.6KEGG通路富集分析核心靶点涉及的KEGG通路有9条(表5，图6)，淫羊藿-AD核心靶点基因的KEGG通路主要涉及神经活性配体-受体互作通路、钙信号通路、5-羟色胺能突触通路、cGMP-PKG信号通路、cAMP信号通路、雌激素信号通路、胆碱能突触通路、缝隙连接通路、PI3K-Akt信号通路。

图6 KEGG通路分析气泡图

表5 KEGG富集分析结果

2.7分子对接选取核心靶点中Degree值前2者(ACHE，SLC6A4)与淫羊藿有效成分中Degree值前2者，通过Chem3D、Pymol、AutoDock和Vina软件进行分子对接验证，结果提示2,7-二氢高刺桐春与ACHE中的HIS-381、GLN-527以氢键连接(图7a)，与SLC6A4中的ARG-390、GLN-567以氢键连接(图7b)；去水淫羊藿与ACHE中的ASN-233以氢键连接(图7c)，与SLC6A4中的GLU-493以氢键连接(图7d)。结合能是几个粒子从自由状态结合成为一个复合粒子时所释放的能量。结合能数值越小，分子结构就越稳定。结合能<-5 kJ/moL认为对接结果比较稳定，越低则越稳定，结果显示配体与受体两两对接，其结合能均低于-5 kJ/moL，且均有氢键相连，见表6。

表6 配体-受体对接结合能表

3 讨论

经网络药理学分析，本研究获得3条淫羊藿-AD的显著通路，分别是神经活性配体-受体互作通路、钙信号通路和5-羟色胺能突触通路。神经活性配体-受体互作通路是调节神经系统多种生理生化过程的重要通路，与神经功能直接相关。神经活性配体通过与细胞内受体结合来影响神经元功能，细胞内受体具有结合转录因子和调节基因表达的能力。因此,破坏参与神经活性配体-受体相互作用的基因会导致记忆功能下降[10]。淫羊藿靶点富集在神经活性配体-受体互作通路多达13种,包括CHRM2,GRIA2,CHRM1,HTR1A,HTR2C,ADRB2,HTR2A,OPRM1,F2,ADRA1A,ADRA2B,ADRA2A,DRD2。淫羊藿可通过调节该通路改善记忆功能。

钙离子(Ca2+)是包括植物在内的所有真核生物中普遍存在的第二信使[11]。细胞内钙稳态平衡在神经元中发挥着关键的调节作用，包括生长分化，动作电位，突触重塑和学习记忆等。证据表明[12]神经元的钙稳态失调可能与AD的发病有关，钙中断可诱导突触缺陷，促进Aβ斑块和神经纤维缠结的积累,导致神经退行性疾病。淫羊藿通过调节钙通道中的CHRM2,CHRM1,NOS3,HTR2C,ADRB2,HTR2A,ADRA1A靶点,减少神经元的损伤,从而改善AD的症状。

5-羟色胺能系统与胆碱能系统、多巴胺能系统、γ-氨基丁酸(GABA)能系统和谷氨酰胺能系统相互作用，在记忆保持和学习中起着关键作用[13]。5-羟色胺能突触通路是重要的神经通路。临床上,常用的西酞普兰、氟西汀、帕罗西汀等可作用于该通路,增加突触5-羟色胺的浓度,减轻AD后期的抑郁症状。淫羊藿成分具有调控5-羟色胺能突触通路的作用,继而改善AD的症状。

综上所述,淫羊藿具有多靶点、多通路治疗AD的作用,其主要通路涉及神经活性配体-受体相互作用通路、钙信号通路、5-羟色胺能突触通路、缝隙连接通路、cGMP-PKG信号通路、cAMP信号通路、雌激素信号通路、胆碱能突触通路、PI3K-Akt信号通路等。本研究也为进一步相关实验设计提供思路以及理论依据。