GC-FID内标法测定活血止痛搽剂中乙醇的含量

李世学，郭小玲，易洪宇

萍乡市妇幼保健院临床药学室(江西 萍乡 337000)

活血止痛搽剂为萍乡市妇幼保健院骨科临床使用多年的经验方，该方具有活血止痛，祛瘀通络的功效，用于跌打损伤等骨科疾病。活血止痛搽剂制备方法采用不同浓度的乙醇浸泡两周，取上清液，滤过，分装，即得。该搽剂通过乙醇提取，醇沉工艺制备而成。其制备所得酊剂中乙醇浓度的多少，决定着该制剂的有效成分的保留率和无效成分的去除率。因此对其乙醇浓度的精准测定，决定着产品的质量[1-2]。在对含乙醇的制剂中乙醇含量的测定，目前常见的测定方法主要包括酒精计法、计算法、倍数法[3]，此三种测定方法，均为工业生产制剂中乙醇含量的大致测定方法，均不能精准的测定其乙醇浓度[4]，同时，测定结果不稳定，测定结果与实际测定结果偏差较大。

目前测定乙醇的含量(GC)已有文献报道[5-7]，参考文献报道确立了本方法，建立GC-FID内标法，以期为活血止痛搽剂中乙醇含量的测定提供依据。

1 实验材料

1.1仪器与试药Agilent 7820A气相色谱仪、Agilent7820AGC Remote Controller ChenStation Edition气相工作站。活血止痛搽剂(自制，批号：20210320，20210321，20210322)，乙醇、正丙醇为色谱纯，水为超纯水。

1.2色谱条件色谱柱：DB-1键合交联聚乙二醇为固定液的毛细管柱(60 m×0.32 mm×0.32 μm，Agilent Technologies)；柱温起始温度50 ℃，维持7 min，再以10 ℃/min的速率升温至110 ℃；进样口温度190 ℃；检测器温度220 ℃；CT-1A型氮氢空气发生器(杭州伽轩科技有限公司，JP-300型)，固定分流比为10∶1；进样量1 μL；采样时间7 min，理论板数按乙醇峰计算应不低于8 000，乙醇峰与正丙醇峰的分离度大于1.5。

2 方法与结果

2.1溶液的制备

2.1.1 对照品溶液制备 精密量取恒温至20 ℃的无水乙醇5 mL，置于100 mL量瓶中，精密加入恒温至20 ℃的正丙醇(内标物质)5 mL，加水稀释至刻度，摇匀，精密量取上述溶液1 mL，置于100 mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀作为对照品溶液。

2.1.2 供试品溶液的制备 精密量取20 ℃的活血止痛搽剂一批(批号2021032)5 mL，置100 mL量瓶中，精密加入恒温至20 ℃的正丙醇5 mL，用水稀释至刻度，摇匀，精密量取该溶液1 mL，置100 mL量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。

2.1.3 校正因子测定 精密量取恒温至20 ℃的无水乙醇4 mL、5 mL、6 mL，分别置100 mL量瓶中，分别精密加入恒温至20 ℃的正丙醇(内标物质)5 mL，用水稀释至刻度，摇匀，精密量取上述各溶液1 mL，分别置100 mL量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。取上述3种溶液各1 μL，注入气相色谱仪，分别连续进样3次，测定峰面积，计算校正因子f。

f=(As/Cs)/(AR/CR)

As：内标物质的峰面积；AR：对照品的峰面积；Cs：内标物质溶液的浓度；CR：对照品溶液的浓度。

2.2方法学试验

2.2.1 专属性考察 取超纯水空白溶液、对照品溶液和供试品溶液，按1.2色谱条件，分别进样1 μL，采集气相色谱图，结果显示乙醇色谱峰与内标物正丙醇色谱峰完全分离，供试品乙醇色谱峰保留时间与对照品对应一致且无干扰，分离度>1.5，空白溶液在相应的保留时间位置无干扰峰出现，表明该方法专属性良好，见图1。

A：对照品溶液；B：供试品溶液；C空白溶液。

2.2.2 线性关系考察 取上述制备的对照品溶液，分别精密量取恒温至20 ℃的无水乙醇1、2、5、10、25、50 mL，分别置于100 mL量瓶中，精密加入恒温20 ℃的正丙醇(内标物质)5 mL，加水稀释定容至100 mL，摇匀，精密量取上述溶液1 mL，分别置于100 mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，制备为不同系列的对照品溶液，按上述1.2色谱条件，分别进样1 μL，采集气相色谱图，记录峰面积，以进样浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)，进行线性回归分析，绘制标准曲线，计算回归方程，回归方程为Y=2.578 1×103X-10 224.80，r=0.999 7(n=6)。结果表明：乙醇在0.001%～0.05%的浓度范围内线性关系良好。

2.2.3 精密度考察 取上述对照品溶液，按1.2项色谱条件连续进样6次，每次进样1 μL，记录峰面积，结果，乙醇峰面积RSD=0.81%(n=6)，表明仪器精密度良好。

2.2.4 稳定性试验 取上述制备的供试品溶液，按1.2项下色谱条件，分别于0、2、4、8、12、24 h时，分别进样1 μL，记录峰面积，结果，乙醇峰面积的RSD=1.67%(n=6)；表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.2.5 重复性试验 取活血止痛搽剂(批号20210320)，按供试品制备方法，制备6份，按1.2项下色谱条件，分别进样1 μL，记录乙醇和正丙醇色谱图，以内标法计算乙醇的含量，结果乙醇平均浓度为74.26%，RSD=1.55%(n=6)，表明方法重复性良好。

2.2.6 加样回收率试验 精密量取活血止痛搽剂(批号20210320)3 mL，连续量取6份，分别置于100 mL量瓶中，分别加入无水乙醇2 mL，然后精密加入恒温至20 ℃的正丙醇5 mL，用水稀释至刻度，摇匀，精密量取该溶液1 mL，置100 mL量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，按上述1.2项下色谱条件进行测定，分别进样1 μL，记录乙醇和正丙醇色谱图，以内标法计算峰面积，计算回收率，结果见表1。平均回收率为100.33%，RSD=1.57%(n=6)，结果表明该实验良好，数据可靠，方法可行。

表1 加样回收率试验结果

2.33批活血止痛搽剂中乙醇的浓度测定3批活血止痛搽剂中乙醇的平均浓度为74.70%，止痛搽剂中乙醇浓度的RSD为0.54%，表明3批样品乙醇浓度偏差较小，乙醇浓度相当，见表2。

表2 3批活血止痛搽剂中乙醇的浓度结果

3 讨论

采用气相色谱法以氦或氩等作为载气，通过将乙醇液体稀释后注入色谱柱中，采用合适的检测温度，将所需测定组分分离，从而测定其待测组分的含量[8-9]，该方法应用范围广，样品用量少，灵敏度高，可测得实际浓度[10]。

本实验采用气相色谱-毛细管柱法，建立GC-FID，正丙醇作内标物法测定活血止痛搽剂中乙醇浓度，用此方法准确度高，可准确测定其制剂制备过程中的乙醇浓度控制和成型制剂后的质量检测提供可靠的数据支撑。虽然本实验测定的乙醇浓度准确度较高，但是乙醇浓度的不同，导致其制剂中有效成分的溶出情况不同，因此后续将根据溶出的有效成分，进行最佳乙醇浓度的工艺筛选，同时对活血止痛搽剂的药理及临床疗效研究，将为后续研究的重点。