探究红曲米的最适红曲接种量

万 乐 冀鹏翼 程金新

（中国人民警察大学，河北 廊坊 065000）

红曲是一种历史悠久的中国传统发酵食品，被中医认为是一种珍贵的保健品，也被广泛应用于食物加工烹饪。

近年研究发现，红曲发酵过程可以获得各类活性代谢产品。由于红曲霉的活性代谢产物丰富，并具有特定的功能，其中某些代谢产物对人类有药用价值，但某些代谢产物具有毒性，对人体有害。其中，桔霉素具有一定的代表性，东亚以及一些欧洲国家对此较为关注，并进行了深入研究。

在近年的研究中，红曲菌的代谢产物和其代谢产物的抗氧化能力被广泛地运用到动物（如断奶仔猪、山羊等）、植物（如燕麦、苦荞、金钗石斛、紫苏叶等）、真菌（香菇等）以及人体的各个方面（如人体经络电压等），红曲制品也越来越多（如红曲饼干、红曲米、红曲酒等），笔者从红曲米入手，再经过微生物、发酵等相关知识，想探究出红曲米的最适红曲接种量，从而发挥红曲米的最大功效。

在今年的研究中，可以了解到，桔霉素的检测方法主要有抑菌圈法、高效毛细管电泳法、气相色谱-质谱法（GCMS）以及高效液相色谱-串联质谱法（HPLC-MS/MS）等。

1 材料与方法

1.1 材料、仪器与设备

材料包括Tween80、葡萄糖、鱼粉蛋白胨、YeastExtrac、KCl、FeSO·7HO、大米、甲醇、碳酸钠、芦丁、没食子酸、乙醇、福林酚试剂、NaNO、AlCl、NaOH、DPPH、抗坏血酸、Tris、EDTA·2Na、盐酸溶液、邻苯三酚、乙腈、甲酸、磷酸、超纯水。

仪器设备包括单人单面净化工作台、LRH-150B生化培养箱、HC-2066高速离心机、紫外可见分光光度计：unic、ATX124电子天平、CDE-220E2果汁机、Agilent1200高效液相色谱系统（配置四元梯度泵、在线真空脱气机、自动进样器、荧光检测器）；Agilent6410液相色谱-三重四级杆串联质谱CitriTsetTM免疫亲和柱，免疫亲和净化装置、桔霉素标准溶液。

甲醇、乙腈、甲酸和磷酸均为色谱纯，其余试剂为分析纯。

桔霉素标准溶液：用乙腈将一定量的桔霉素标准储备溶液稀释10倍，制成标准溶液，于4℃冰箱中保存。

1.2 试验方法

先浸米，把米沥干，再把沥干之后的大米灭菌，分别把2%、4%、6%、8%、10%红曲菌接种到相同量的大米上，然后发酵7天。把发酵好的大米分别进行烘干、研磨、过筛的操作，把五种接种量的大米粉末样品各取0.02g放入试管中，然后加入5mL80%乙醇溶液于45℃下水浴提取1h，待测提取液制作完毕。

吸取100μL适当稀释的样液于比色管中，然后加入50μL福林酚试剂，混匀，反应3min~8min，再吸取150μL20%NaCO溶液加入比色管中，再加700μL水定容至1mL，混匀，室温下静置20min后，于UV-2802S型紫外可见分光光度计中波长为765nm处测得吸光值，然后通过制作好的没食子酸溶液浓度的标准曲线计算出各接种量下样液总多酚的含量。

吸取100μL适当稀释的酒样于比色管中，加入蒸馏水定容至500μL，再依次加入5%NaNO30μL，摇匀后静置反应5min，之后再加入10%AlCl30μL，摇匀后静置6min，依次加入200μL 4% 的 NaOH，摇匀后，继续添加240μL70%乙醇定容至1mL，静置反应20min，于UV-2802S型紫外可见分光光度计中波长为510nm处测吸光值，然后通过制作好的芦丁溶液浓度的标准曲线计算出各接种量下的样液总黄酮的含量。

吸取50μL适当稀释的样液加入比色管中，然后加入400μL60μmDPPH溶液，充分摇匀后，于室温下，放于暗处，静置反应30min后，在UV-2802S型紫外可见分光光度计中515nm下测吸光值，再根据以下公式计算出各接种量下的样液DPPH自由基清除力。

DPPH 自由基清除率（）的计算公式如下。

式中：是空白样的吸光度值；是样品的吸光度值。

根据樊祥，禇庆华，伊雄海等人测定红曲米中桔霉素含量的免疫亲和层析净化-高效液相色谱法，先配置桔霉素标准溶液，再创造色谱条件，然后用研磨好的红曲米制作样液，再通过一定的试验方法（先用研磨好的红曲米融入一定量的甲醇磷酸溶液，然后再过滤，再用磷酸进行稀释，制作出待测样液，再将试验装置连接好，加入样液，调节试验装置开始试验，然后用乙腈洗脱，将洗脱液收集到进样小瓶），来测定样液中桔霉素的含量。之后再进行讨论分析，讨论内容包括色谱条件的选择、标准曲线和测定下限、样品分析、质谱确认。最后再进行统计，将各接种量下的红曲米的桔霉素含量作为纵轴，红曲霉菌接种量作为横轴，制作出直方图，来更清晰地看出红曲米桔霉素含量和红曲霉菌接种量之间的关系，由此来得出更直观更有说服力的结论。

色谱条件：Kromasil100-10C18色谱柱（250mm×4.6mm，5μm）；流动相：甲酸（1+99）溶液与乙腈以体积比1∶1混合的溶液，超声脱气30min，流量1.0mL/min，进样量50μL。

荧光检测：激发波长350nm，发射波长500nm。

液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）条件：COPCELLPAKC 18色谱柱（50mm×2.0mm，3μm）；流动相：A为甲酸（0.1+99.9）溶液B为甲酸-乙腈（0.1+99.9）溶液梯度洗脱；流量0.4mL/min。

电喷雾电离模式，多反应监测（MRM）模式，母离子m/z251.1，子离子m/z233.1和m/z215.3；毛细管电压4.00kV，去溶剂温度350℃，去溶剂气流量10L/min，雾化器压力0.34MPa，碰撞能量：母离子m/z251.1，碎裂成子离子m/z233.1须电离能量11eV，碎裂成m/z215.3需要电离能量19eV。

2 结果与讨论

2.1 总多酚的测定

随着红曲菌接种量增大，总多酚含量先削减，后增大，再削减，从表1可以看出，红曲霉菌接种量为2%时，样品总多酚含量为14.55μg/mL；红曲霉菌接种量为4%时，样品总多酚含量为7.13μg/mL；红曲霉菌接种量为6%时，样品总多酚含量为32.85μg/mL；红曲霉菌接种量为8%时，样品总多酚含量为138.11μg/mL；红曲霉菌接种量为10%时，样品总多酚含量为137.58μg/mL。从图1可以看出，总体上呈现红曲霉菌接种量增添，样品总多酚含量增添的趋势。为了更好地探究红曲霉菌最佳接种量，为工业生产提供理论依据，在该试验的试验结果中应重点关注红曲霉菌接种量为8%和10%时的样品总多酚含量。随着红曲霉菌接种量的增添，8%接种量下的样品总多酚含量却比10%接种量下的高，猜测是由于红曲霉菌接种量越多，其操纵大米基质的养分不竭，滋生发展代谢，导致多酚的含量呈上升趋势，但由于红曲霉菌接种量的增添，毒素的含量也增添，导致8%红曲霉菌接种量下的总多酚含量最高。

表1 各接种量下红曲米总多酚含量数据

图1 红曲米接种量与总多酚含量统计图

2.2 总黄酮的测定

随着红曲菌接种量增大，总黄酮含量先削减，后增大，再削减，从表2可以看出，红曲霉菌接种量为2%时，样品总黄酮含量为2.73μg/mL；红曲霉菌接种量为4%时，样品总黄酮含量为1.22μg/mL；红曲霉菌接种量为6%时，样品总黄酮含量为5.48μg/mL；红曲霉菌接种量为8%时，样品总黄酮含量为25.06μg/mL；红曲霉菌接种量为10%时，样品总黄酮含量为24.87μg/mL并且从图2可以看出，总体上呈现出，随着红曲霉菌接种量的增添，样品总黄酮含量增添的趋势。为了更好地探究红曲霉菌最佳接种量，为工业生产提供理论依据，在该试验的试验结果中应重点关注8%和10%接种量下总黄酮的含量。跟着红曲霉菌接种量的增添，8%接种量下的样品总黄酮含量却比10%接种量下的高，猜测是由于红曲霉菌接种量越多，其操纵大米基质的养分不竭，滋生发展代谢，导致多酚的含量呈上升趋势，但由于红曲霉菌接种量的增添，毒素的含量也增添，导致8%红曲霉菌接种量下的总黄酮含量最高。

表2 各接种量下红曲米总黄酮含量数据

图2 红曲米接种量与总黄酮含量统计图

2.3 DPPH自由基清除力的测定

DDPH自由基较为稳定，溶于甲醇溶液显紫黑色，经实验室波长扫描显示，在515nm波长处有强吸光值。从图3可以看出，随着红曲菌的接种量增大，DPPH自由基断根率先削减，后增添，再削减，如红曲霉菌接种量为2%时，DPPH自由基断根率为31%；红曲霉菌接种量为4%时，DPPH自由基断根率为26%；红曲霉菌接种量为8%时，DPPH自由基断根率为71%；红曲霉菌接种量为10%时，DPPH自由基断根率为65%，但总体上显现随红曲霉菌接种量增添而增添的趋向。为了更好地探究红曲霉菌最佳接种量，为工业生产提供理论依据，在该试验的试验结果中应重点关注8%和10%接种量下的DPPH自由基清除率。随着红曲霉菌接种量的增加，8%接种量下的样品DPPH自由基清除率却比10%接种量下的高，推测红曲菌接种量越大，生长繁殖越旺盛，产生的抗氧化物质（如多酚、黄酮等）基本呈上升趋势，但可能因为红曲霉菌接种量的增加，毒素的含量也增加，所以8%接种量下的DPPH自由基清除率最高。

图3 红曲米接种量与DPPH自由基清除率统计图

2.4 桔霉素含量的测定

从图4可以看出，随着红曲菌接种量增大，桔霉素含量先削减，后增添，再削减，如红曲霉菌接种量为2%时，桔霉素含量为0.0081μg/L；红曲霉菌接种量为4%时，桔霉素含量为0.073μg/L；红曲霉菌接种量为8%时，桔霉素含量为0.0094μg/L；红曲霉菌接种量为10%时，桔霉素含量为0.0191μg/L，但总体上显现随红曲霉菌接种量增添而增添的趋向。为了更好地探究红曲霉菌最佳接种量，为工业生产提供理论依据，在该试验的试验结果中应重点关注8%和10%接种量下桔霉素的含量。随着红曲霉菌接种量的增加，8%接种量下的样品桔霉素含量相比2%到6%接种量下的样品桔霉素含量增加的不多，10%接种量下的样品桔霉素含量却骤然增加，推测是由于红曲霉菌接种量的增加，代谢产物含量增加，刺激了桔霉素含量的增加。

图4 红曲米接种量与桔霉素含量统计图

3 结论

固态发酵过程中，接种量的多少决定着菌体生长的强弱以及利用底物进行代谢的快慢。大米接种一定量的红曲菌后，其总多酚、总黄酮和抗氧化能力得到提高，效果最好的是8%接种量下的大米，总多酚含量达到了138.11μg/mL，总黄酮的含量达到了25.06μg/mL，DPPH自由基断根率到达了71%；同时，当接种量到达10%时桔霉素含量急剧增加，更能说明8%接种量更为合适。根据试验数据，该文对红曲霉培养装置进行了初步设计，该装置的功能是为红曲霉提供最适宜的生长环境，控制红曲霉产生的毒素含量。该课题研究出的红曲最适接种量成果可为开发兼具风味和保健功能的红曲产品提供理论依据，并可应用于实际生产，同时该课题研究也为如何发挥出红曲制品的最大功效作出了贡献，不只探究红曲米的最适红曲接种量，还可以探究红曲纳豆的最适红曲接种量和红曲饼干的最适红曲接种量等；可以从红曲霉菌的接种量多少来提高红曲制品的功效，还可以从控制、减少桔霉素等毒素的含量来提高红曲制品的安全性。