Meyerozyma sp.合成Ag2S量子点及其抗菌性*

张小雪，孙维良，张友德，武 超，邓国志

(1. 安徽大学 资源与环境工程学院，合肥 230601;2. 安徽大学 湿地生态保护与修复安徽省重点实验室,合肥 230601;3. 安徽新宇生态产业股份有限公司，合肥 230601)

0 引 言

近年来，由细菌引起的问题越来越多，其中病原微生物污染引起的生物危害一直被认为是全球范围内危害健康的问题[1]，因此抗菌剂及其应用受到了广泛的关注。常用的抗菌剂有臭氧、次氯酸盐和抗生素等，但这些抗菌剂往往会造成水资源的二次污染[2]、盐化以及造成细菌对抗生素产生耐药性[3]，同时具有高能耗、高运行成本的缺点。因此近些年许多有效的抗菌材料也被开发出来。由于纳米材料具有尺寸小，比表面积大，以及更高的活性等优异特性，因此展现出极大的潜力和广泛的应用前景。其中量子点是一种具有独特光学性质且性能稳定的半导体纳米材料[4]。银基纳米材料具有极其优异的杀菌潜力[5]。因此，在环境净化中得到了广泛的应用。最近的研究报告了 Ag2S纳米粒子对不同类型的耐药细菌(革兰氏阳性和革兰阴性菌)的抑制作用[6-7]。

硫化银(Ag2S)是一种带隙约为(0.9～1.05 eV)半导体材料[8]，Ksp=6.3×10-50[9]，超低的溶度积常数使进入生物体系中的银离子的最小释放量远小于生物医学研究领域中广泛使用的镉源量子点[10]。硫化银(Ag2S)量子点的合成方法有物理法、化学法，包括水热合成法、微波加热法等[8]。Brelle等人在1999年首先报道了通过半胱氨酸和谷胱甘肽修饰合成直径约为9 nm的硫化银纳米粒子[11]。2004年有研究者通过十二烷基硫醇和硫代乙酰胺制备单分散的硫化银纳米粒子[12]。2004年，Ikushima 等合成平均粒径约5.9 nm的Ag2S纳米晶，首次以 Ag2S QDs 命名[13]。真菌是公认的合成金属纳米颗粒的生物对象，因为真菌能够分泌出大量的酶，并且容易控制合成过程[14-15]。因此通过微生物绿色合成硫化银(Ag2S)纳米粒子越来越重要。

本文主要研究真菌生物合成硫化银(Ag2S)量子点并揭示其可能存在的抗菌性。用硝酸银作为银源，用亚硫酸钠作为硫源，在酸性条件下通过酵母菌合成Ag2S纳米粒子。通过倒置荧光显微镜、扫描电镜(SEM)、X射线衍射(XRD)和X射线光电子能谱(XPS)，确定了Ag2S QDs 的合成。此外，通过生物合成的Ag2S QDs研究对革兰阴性菌(大肠杆菌、铜绿假单胞菌)和革兰氏阳性菌(芽孢杆菌)的抗菌性。研究结果为制备Ag2S QDs提供了一条简单、环保、经济的途径。

1 实 验

1.1 试剂与仪器

1.1.1 培养基

LB培养基：5 g/L yeast extract，10 g/L tryptone，5 g/L NaCl，121 ℃ 灭菌 20 min。

R2A培养基：0.5 g/L Tryptone，0.5 g/L酪蛋白氨基酸、0.5 g/L可溶性淀粉、0.5 g/L Yeast Extract、0.05 g/L MgSO4·7H2O、11.80 g/L柠檬酸、13.42 g/L K2HPO4、1.5 mmol/L丙酮酸钠、10 g/L D-glucose，121 ℃灭菌 20 min。

1.1.2 仪 器

全自动冷冻研磨仪，PowerDry LL3000；高速冷冻离心机，美国 SCILOGEX公司；恒温气浴振荡培养箱，常州国华仪器公司；X 射线光电子能谱仪，美国 ESCALAB 250Xi；X 射线衍射仪，日本 SmartLab 9 kW；扫描电镜 REGULUS8230；倒置荧光显微镜 ScopeA1 ZEISS 德国；液相色谱-质谱联用仪，美国 LTQ Orbitrap XL；紫外-可见光谱仪，美谱达UV-1100。

1.2 菌株的培养

本研究中使用的菌株是从大庆油田土壤中获得。

在无菌操作台挑取Meyerozymasp.菌，转入含有500 μL R2A培养基的1.5 mL EP管中，放入30 ℃ 、150 r/min摇床中培养12 h转入含有50 mL LB的250 mL锥形瓶中，放入30 ℃、 150 r/min摇床中培养24 h ，如图1(c)所示，为显微镜下观察到的Meyerozymasp.菌，形态近似球形。

1.3 Ag2S纳米粒子的合成

将Meyerozymasp.菌戳入含有 500 μL R2A培养基后，放入摇床，30 ℃ 、150 r/min，培养12 h，再将500 μL菌液加至含有50 mL R2A培养基的250 mL形瓶中并加入90 μL 50%葡萄糖和50 μL 1.5 mmol/L丙酮酸钠作为碳源，放入摇床，30 ℃、150 r/min，培养24 h；向锥形瓶中加入1 mmol/L AgNO3和1 mmol/L Na2SO3,放入摇床，30 ℃ 、150 r/min，培养48 h,溶液颜色变为浅褐色。通过高速冷冻离心机8 000 r/min、5 min离心；将离心后的上清液倒出，加入纯水进行冲洗两次，将上清液倒出。沉淀用纯水重悬后于全自动冷冻研磨仪破碎细胞，8 000 g/min、10 min离心，上清液用1kD透析袋透析后，用0.22 μm滤头过滤，得到纯化后的Ag2S。

1.4 Ag2S纳米粒子的材料分析方法

取20 μL合成48 h 后Ag2S样品于玻片上，通过倒置荧光显微镜观察发光情况；取合成48 h后Ag2S样品 2 mL 离心(1 000 r/min、10 min)弃上清液，用戊二醛和乙醇处理，再利用扫描电镜(SEM)观察粒子形貌；冷冻干燥后的粉末用X射线光电子能谱(XPS)分析确定合成的Ag2S纳米材料的元素组成和价态；X射线衍射仪(XRD)测定合成样品的晶型。样品离心后的上清在190～700 nm范围内利用紫外-可见光谱仪(UV-Vis)全波长扫描。

1.5 Ag2S纳米粒子的抗菌性

E.coli、Pseudomonasaeruginosa、Bacillus转接入500 μL LB 培养基后，放入摇床，30 ℃ 、150 r/min，培养12 h；将OD600=0.5的菌液用涂布棒均匀地涂抹在LB平板上，放入直径为5 mm滤纸片，将不同浓度的Ag2S纳米材料加入到滤纸片中观察抑菌圈大小并测量其直径；通过滴板杀菌研究Ag2S QDs对OD600=0.2的E.coli、Pseudomonasaeruginosa、Bacillus的抗菌活性。

抗菌率=[(A-B)/A]×100

式中：A为对照组平均菌落数；B为实验组组平均菌落数[16]。

2 结果与讨论

2.1 Ag2S QDs的合成及表征

在含有Meyerozymasp.的R2A培养基中加入1 mmol/L AgNO3和1 mmol/L Na2SO3培养48 h后,如图1(a)和(b)所示，培养基颜色发生变化推测Ag2S QDs的合成。取10 μL菌液滴入到玻片上制样，玻片倒置放在载物台上，倒置荧光显微镜观察，如图3(a)、(b)和(c)所示。图3(a)为在明亮背景中的成像，图3(b)为在明亮背景中，在40倍镜下，用紫外荧光激发块激发，可以观察到部分菌体出现荧光，图3(c)为关闭房间内的电灯和倒置荧光显微镜的白光下的成像，推测有Ag2S QDs的合成。

图1 Meyerozyma sp.合成Ag2S QDsFig 1 Biosynthesis of Ag2S QDs by Meyerozyma sp.

图2 Meyerozyma sp.合成Ag2S QDs的UV-Vis图Fig 2 UV-Vis of the synthesized Ag2S QDs by Meyerozyma sp.

2.1.1 紫外-可见光光谱(UV-Vis)分析

金属纳米粒子在UV-Vis上的表面等离子体共振吸收峰的峰位和峰形状受纳米粒子的尺寸、分布范围以及环境等方面因素的影响[17]。合成样品通过紫外可见光谱分析，以纯水为空白样作基线，将样品稀释后加入到比色皿中进行全波长扫描，Uv-vis结果显示，如图2所示，在410 nm处出现表面等离子体共振吸收峰，表明Ag2S QDs的合成。已有文献证实[18]。同时该表面等离子体共振激子峰的半高宽比较大，表明合成纳米粒子的尺寸分布范围较广[19]。

2.1.2 扫描电镜SEM分析

如图4所示，为反应后样品的扫描电镜(SEM)，图4(a)为带有菌体和材料的样品，可以观察到纳米粒子附着在细胞表面，近似球形的Meyerozymasp.细胞发生轻微变形，表明了Ag2S QDs在细胞表面合成。图4(b)为合成Ag2S QDs的扫描电镜(SEM)，观察到合成纳米粒子为球形，出现团聚现象。

图3 Meyerozyma sp.合成Ag2S QDs 倒置荧光显微镜图(×40)Fig 3 The inverted fluorescence microscopy of the biosynthesis of Ag2S QDs by Meyerozyma sp. (×40)

图4 Meyerozyma sp.合成Ag2S QDs 扫描电镜(SEM)Fig 4 SEM of the biosynthesis of Ag2S QDs by Meyerozyma sp.

2.1.3 XRD、XPS分析

通过X射线衍射图谱确定合成的Ag2S QDs的晶型。如图5(a)所示由Meyerozyma sp.尝试合成的Ag2S QDs X射线衍射图谱与对照。样品在26.3°、28.9°、31.5°、46.2°、54.1°、57.1°、67.9°出现明显的衍射峰，与标准PDF(14-0072)卡片中( 1 1 0) ，( -1 1 2) ，(-1 2 3)，( 0 4 1) ，(1 1 4)， (2 3 2)晶面衍射峰对应,确定其晶型为单斜α-Ag2S。根据XPS图谱分析Meyerozymasp.合成Ag2S QDs的元素价态，如图5(b)、(c)和(d)所示，通过XPS图谱可以确定合成纳米材料包含C、N、O、Ag、S元素。对于Ag 3d在373.9和368 eV处大的峰相对应于Ag3d 3/2和Ag3d 5/2，表明了Ag+的存在[20]。对于S 2p在163.7和161.9 eV处的峰相对应于S 2p 和S 2p 1/2，表明了S2-的存在，结果与NIST XPS数据库相对应。进一步证明了Ag2S QDs的合成。

图5 Meyerozyma sp.合成Ag2S QDs的X射线衍射图谱和XPS图谱Fig 5 XRD and XPS patterns of the synthesized Ag2S QDs by Meyerozyma sp.

2.2 Ag2S QDs抗菌性测试

2.2.1 纸片扩散法

通过纸片扩散法，测试Meyerozymasp.合成Ag2S QDs对革兰阴性菌和革兰氏阳性菌的抗菌性。如图6和表1所示，随着加入Ag2S QDs的浓度从10 mg/L增加到50 mg/L，抑菌圈的直径逐渐增大。表明随着抗菌材料浓度的增加，抗菌效果越好，其中大肠杆菌和铜绿假单胞菌的抑菌圈比芽孢杆菌的抑菌圈直径大，表明Ag2S QDs对革兰阴性菌的抗菌性更强。这可能与细菌独特的结构有关，革兰氏阳性菌的肽聚糖层一般较革兰阴性菌厚，由于金属纳米颗粒难以穿透细胞细菌胞质[21]，从而使其对金属抗菌剂的敏感性降低。

2.2.2 滴板杀菌

通过96孔板测定Ag2S QDs对细菌的最小抑制浓度(MIC)为7.5 mg/L使用滴板杀菌的方式测定Ag2S QDs对致病菌的抗菌率。如图6(b)、(c)和(d)所示，Ag2S QDs浓度为7.5 mg/L时，在2 h内对OD600=0.2的大肠杆菌、芽孢杆菌和铜绿假单胞菌的抗菌性测试。图6(b)对铜绿假单胞菌的抗菌率在10 min时约为98%，30 min时抗菌率达到100%。图6(c)对芽孢杆菌在2 h内抗菌率约为99.9%。图6(d)对大肠杆菌10 min时抗菌率达到90%，30 min时抗菌率为99.99%，90 min时抗菌率可达到100%。

表1 Meyerozyma sp.合成Ag2S QDs的抑菌圈直径

图6 Meyerozyma sp.合成Ag2S QDs的抑菌圈及抗菌性Fig 6 Inhibition zone and antimicrobial activity of Ag2S QDs synthesized by Meyerozyma sp.

2.2.3 Ag2S QDs抗菌机理

通过扫描电镜SEM分析Ag2S QDs的抗菌机理。有研究表明其杀菌效果可能与纳米粒子表面自由基的形成有关。这些自由基与细菌膜脂相互作用，导致膜功能受损[8]。如图7所示，图7(a)、(b)分别为未处理和Ag2S QDs处理后的铜绿假单胞菌，可以清晰地观察到，铜绿假单胞菌的细胞为杆状，处理前表面光滑，无褶皱。经过Ag2S QDs处理后，铜绿假单胞菌的细胞表面出现褶皱。图7(c)、(d)分别为未处理和Ag2S QDs处理后的芽孢杆菌，形状为杆状。处理前芽孢杆菌细胞完整，Ag2S QDs处理后，芽孢杆菌的细胞表面轻微变形。图7(e)、(f)分别为未处理和Ag2S QDs处理后的大肠杆菌，形状为杆状。处理前大肠杆菌细胞完整且表面光滑，Ag2S QDs处理后，大肠杆菌的细胞表面出现明显破损、凹陷、变形，与报道相似[22-23]。通过SEM扫描电镜分析，推测Ag2S QDs对细菌细胞的作用可能是吸附在细胞表面后使细胞膜发生破损，同时小粒径的Ag2S QDs可能穿透细菌膜，破坏DNA和蛋白质，从而对细胞造成损坏，进而导致了细胞死亡[24]。

图7 扫描电镜图：(a)、(b)分别为未处理和Ag2S QDs处理后的铜绿假单胞菌；(c)、(d)分别为未处理和Ag2S QDs处理后的芽孢杆菌；(e)、(f)分别为未处理和Ag2S QDs处理后的大肠杆菌Fig 7 Scanning electron microscopy

3 结 论

利用从大庆油田土壤中筛出的耐重金属真菌，季也蒙毕赤酵母Meyerozymasp.，还原硝酸银和亚硫酸钠合成具有单斜α-Ag2S晶型硫化银(Ag2S)量子点，并借助X射线光电子能谱分析(XPS)、X射线衍射(XRD)、倒置荧光显微镜、扫描电镜等手段对合成的硫化银(Ag2S)量子点进行表征，同时通过纸片扩散法和滴板杀菌研究了合成的硫化银(Ag2S)量子点的抗菌性。得到的结果表明，通过Meyerozymasp.菌合成纳米粒子，对革兰阴性菌包括Escherichiacoli和Pseudomonasaeruginosa以及革兰氏阳性菌Bacillus均有显著的抗菌性，并随着材料浓度的增加，抗菌性逐渐增强。对铜绿假单胞菌、大肠杆菌分别在30和90 min时抗菌率达到100%，对芽孢杆菌在2 h内抗菌率约为99.9%。根据对处理后的Escherichiacoli、Pseudomonasaeruginosa和Bacillus的扫描电镜分析，推测造成细菌死亡的原因可能是由于Ag2S吸附在细菌细胞膜表面，造成膜的损伤，进而导致细胞死亡。研究为硫化银(Ag2S)量子点的合成提供了一条简单环保的途径，由于其荧光和抗菌特性，可用于荧光探针及抗菌剂等方面的应用。