生活饮用水中总大肠菌群多管发酵法与纸片法检测方法比较

王锋 刘婷

（济南铁路疾病预防控制中心 山东济南 250001）

1 前言

“总大肠菌群”按照GB/T5750.12-2006国家标准的术语和定义是指一群在37℃培养24 h能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。生活饮用水中总大肠菌群主要来自人和温血动物粪便，还可能来自植物和土壤，总大肠菌群是评价饮用水卫生质量重要微生物指标之一，可以指示肠道传染病传播的可能性[1]，具有广泛的卫生学意义。目前我国现行的生活饮用水检测标准GB/T5750.12-2006检测方法是：多管发酵法、滤膜法与酶底物法。大部分疾控中心所使用的方法都是多管发酵法。2015年国家环境保护部发布中华人民共和国国家环境保护标准（HJ755-2015）将纸片法做为水质检测的标准方法。现将多管发酵法与纸片法测定水中大肠菌群方法比较如下：

2 试剂与仪器

2.1 试剂

乳糖蛋白胨培养液，伊红美蓝培养基，革兰氏染色液（多管发酵法所用培养基等均来自广东环凯）；总大肠菌群测试纸片（广东达元绿洲）；大肠埃希菌标准质控菌株（ATCC25922）阴沟肠杆菌（ATCC13047）、弗氏柠檬酸杆菌标准菌株（ATCC43864）金黄色葡萄球菌ATCC25923枯草芽孢杆菌（ATCC 6633）（所有标准菌株均来自广东环凯）。

2.2 仪器设备

LRH-250A生化培养箱（上海一恒），生物安全柜（力新仪器），显微镜（日本奥林巴斯）。

3 实验方法原理

3.1 多管发酵法

多管发酵法测定水中总大肠菌群，将水样接种到乳糖蛋白胨培养液中，36±1℃培养24±2 h，进行初发酵，如所有乳糖蛋白胨培养管都不产酸产气则可报告为总大肠菌群阴性。如有产酸、产气的发酵管则将产酸、产气管分别转种在伊红美蓝琼脂平板上，于36±1℃培养18~24 h，挑选深紫黑色、具有金属光泽或紫黑色、不带或略带金属光泽及淡紫红色、中心较深的特征菌落作革兰氏染色，镜检。经染色镜检为革兰氏阴性无芽孢杆菌，同时接种乳糖蛋白胨培养液，36±1℃培养箱中培养24±2 h，有产酸产气者，即证实有大肠菌群存在。根据证实为总大肠菌群阳性的管数，再通过查MPN表，就可得出相应的总大肠菌群的浓度值[2]。

3.2 纸片法

将一定量的水样以无菌操作的方式接种到水质大肠菌群纸片上，37℃（测定总大肠菌群）或44.5℃（测定耐热大肠菌群或粪大肠菌群）培养24 h，利用总大肠菌群在生长繁殖时，产酸使pH值降低，使纸片中的指示剂溴甲酚紫指标剂由紫色变黄色，同时，产气过程相应的脱氢酶在适宜的pH范围内，催化底物脱氢还原纸片中的TTC形成红色的不溶性的三苯甲臜（TTF），使蓝色的纸片背景下形成黄色并显示出红色斑点（或红晕）。通过上述指示剂的颜色变化就可对是否产酸产气作出判断，从而确定是否有总大肠菌群存在。再通过查相应MPN表，就可得出相应的总大肠菌群的浓度值[3]。

3.3 特异性试验

一般认为总大肠菌群包括大肠埃希氏菌、柠檬酸杆菌、产气克雷白氏菌和阴沟肠杆菌等[4]。用大肠埃希菌标准质控菌株（ATCC25922）阴沟肠杆菌（ATCC 13047）、弗氏柠檬酸杆菌标准菌株（ATCC43864）作为阳性对照菌株；金黄色葡萄球菌（ATCC 25923）、枯草芽孢杆菌（ATCC 6633）作为阴性对照菌株，各菌株选择1~2个合适稀释度分别用纸片法与多管发酵法测定，同时做空白试验。

3.4 样品检测

为保证2种方法对比试验结果的精确性和方便统计，水样必需要有一定的阳性检出率，同时样本的MPN值应尽量控制在100 MPN/100 ml以下，以10~30 MPN/100 ml为宜[5]。用2种方法的平行测定。

3.5 数据统计

用Excel软件和SPSS21.0软件进行数据整理并统计数据。

4 结果与分析

4.1 适用性实验结果

结果表明，多管发酵法与纸片法对总大肠菌群的阳性菌株结果均为阳性，阴性对照菌株结果均为阴性。说明纸片法测定水中总大肠菌群具有很好的适用性，与多管发酵法在适用性上一致，详见表1。

表1 多管发酵法与纸片法对的适应性试验结果

4.2 多管发酵法与纸片法检测结果比较

对64份样本进行总大肠菌群检测结果见图1。多管发酵法检出总大肠菌群55份，检出率为85.9%（55/64）；纸片法检出总大肠菌群53份，检出率为82.8%（53/64），2种方法检出率差异无统计学意义（χ2=0.237，P=0.6264）（见表2）。2种方法检测报告结果，均检出总大肠菌群51份，检出符合率为92.7%（51/55），均未检出7份，未检出符合率为77.8%（7/9）；差异无统计学意义（配对χ2=0.167，P=0.688），见表2。

表2 多管发酵法与纸片法总大肠菌群检出率情况

表3 多管发酵法与纸片法检测总大肠菌群结果比较（配对χ2检验）

4.3 微生物检测

数据为偏态分布，按其统计学分析要求，其检测结果全部经对数（以10为底）转换后进行分析[3]。多管发酵法与纸片法两种方法的配对变量统计描述见表4，配对间的相关性分析见表5，通过表5可以看出，2种方法的相关系数R=0.825，P=0.00；R值趋近于1，说明2组数据具有相关性，且说明2组数据的相关性趋于一致。由表6线性回归可见，检测结果Sig=0.156，回归系数t检验t=1.434，说明2种方法检测水中总大肠菌群没有显著差异。

表4 纸片法与多管发酵法统计描述

表6 多管发酵法与纸片法实验结果的线性回归

5 讨论

通过以上试验结果表明，纸片法与多管发酵法相比较，在适用性上两者无差异，均可检测水中总大肠菌群。通过2种方法对样品检测结果分析其检测结果在统计学上差异也无显著性；2种方法检测数据线性相关，且相关性趋于一致，通过回归分析两种方法没有显著性差异，具有等效性。现行的《生活饮用水检测标准检验方法微生物指标》（GB/5750.12-2006）中主要方法为多管发酵法与滤膜法及酶底物法，还没有纸片法。多管发酵法准备工作繁琐，要配制多种培养基，所需设备也较多，检测时间长，需要72 h才能出结果；而纸片法所需培养基少，基本不需要准备工作，24 h就可以出结果。纸片法具有操作简便、省时、省力的特点，对于大批量水样品及应急突发事件中的总大肠菌群的检测，能够更快捷、更准确的报告检测结果，所以可以将纸片法可以做为生活饮用水的一种检测方法写进国家标准。