流式细胞术在成熟B 细胞淋巴瘤诊断中的应用

刘新蕾，周慷，肖洪波，唐宏炜

重庆医科大学附属第二医院血液内科，重庆 400000

淋巴瘤是淋巴结或淋巴组织的恶性肿瘤，因其临床表现的多样性及建立诊断的复杂性使得该病的诊断具有一定的挑战性。世界卫生组织（World Health Organization,WHO）在对淋巴肿瘤性疾病的界定中指出，对淋巴瘤的诊断需要病理形态学（活检、骨髓及血细胞形态学）、免疫组织化学（免疫表型）、流式细胞术（flow cytometry,FC）、细胞遗传学以及结合临床表现综合诊断和多学科参与[1]。目前，病理学诊断仍是确诊淋巴瘤的金标准，但其有一定的局限性，包括操作复杂且耗时长，不能满足对进展快和特殊部位的淋巴瘤快速诊断、及时治疗的要求等。而流式细胞术能够快速识别多种、体量较大的细胞群，判断细胞的克隆性，且耗时少，可实现快速诊断[2]。其中，多参数流式细胞术（multipa‐rameter flow cytometry,MFC）在临床上广泛用于评估复杂的细胞混合物[3]。同时流式细胞术还可用于微小残留病变（minimal residual disease,MRD）的监测，MRD 检测对血液病患者的治疗管理具有显著影响。MFC-MRD 诊断为表型识别耐药/复发性肿瘤细胞提供了独特的机会，为临床工作者在制订治疗决策时提供了方向[4]。本文主要介绍流式细胞术在成熟B 细胞肿瘤的应用。

1 成熟B 淋巴细胞肿瘤

B 淋巴细胞增生性疾病（B-lineage lymphoprolif‐erative disorders,B-LPD）中普遍存在的CD19 表达是应用流式细胞术的第一个强制性门控步骤，然后通过轻链限制性检测和抗原错译表达（特别是泛T 抗原CD5 的表达）来确定异常的成熟B 淋巴细胞[5]。

1.1 CD5+小细胞成熟B 淋巴细胞肿瘤

慢性淋巴细胞白血病/小细胞淋巴瘤（chronic lymphocytic leukemia/small lymphocytic lymphoma,CLL/SLL），是一种由单克隆成熟小B 细胞组成的B细胞肿瘤[6]。通过血液流式细胞术足以诊断CLL/SLL，通常不需要活组织检查。CLL/SLL 的免疫表型通常为一种轻链限制性表达（kappa 或lambda）和B 细胞抗原受体（B-cell antigen receptor,BCR）相关复合物的弱表达。典型的CLL/SLL 免疫表型包括：CD5+、CD23+、CD43+/-、CD10–、CD19+、CD20 弱阳性、slg 弱阳性、cyclinD1–。需要注意的是，某些病例可能是slg 强阳性，CD23-或弱阳性，有些套细胞淋巴瘤（mantle cell lymphoma,MCL）可能出现CD23+，因此，在所有CLL/SLL 患者中应考虑进行免疫组织化学检测cyclinD1 或FISH 检测t（11，14），并且应该在具有非典型免疫表型（即CD23 弱阳性或阴性、CD20+、sIg+）的患者中进行[7]。CD200 是鉴别CLL 和MCL 的较特异的免疫表型，CD200 对CLL 的敏感性很高[8]，CLL 的研究几乎普遍显示，CD200 阳性率高于97%，大多数报告接近99%，而在MCL 的CD200的表达普遍为阴性。一旦CLL/SLL 的诊断成立，对预后标志物的检测十分重要。目前普遍接受的能够预测CLL 患者预后的指标包括免疫球蛋白重链可变（immunoglobulin heavy chain variable,IGHV）基因、CD49d 和ZAP-70/CD38 表达的体细胞突变，以及染色体异常（染色体13q、17p 和11q 缺失以及12三体）和TP53、ATM、NOTCH1、BIRC3 和SF3B1 基因复发突变的鉴定[9]。不表达ZAP-70 或CD38 的CLL/SLL 患者预后更好[10]。没有免疫球蛋白重链可变基因（immunoglobulin heavy chain variable region,IgVH）突变的CLL 患者中白血病细胞表达高水平的ZAP-70，而具有IgVH 突变的CLL 患者中白血病细胞几乎不表达ZAP-70[11]。在一线治疗中，非突变重链基因对BTK 抑制剂的反应比化疗更好[12]。与ZAP-70 流式细胞术评估相比，CD49d 检测容易区分阳性和阴性患者，从而实现可靠的预后风险分层[9]。治疗期间和治疗后可测量的残留病灶（measurable re‐sidual lesions,MRD）的准确量化对于预测CLL 治疗的临床结果至关重要。MRD 是化学免疫疗法和同种异体移植后无进展生存期（progression free sur‐vival,PFS）和总生存期（overall survival,OS）的独立预后标志物，可用于决定低风险遗传学患者何时停止治疗，目前已成为评估临床终点前随机试验治疗效果的一个公认替代指标[13]。

套细胞淋巴瘤来源于淋巴滤泡外套区生发中心前的B 细胞，临床上多数患者表现为Ⅲ或Ⅳ期，常常累及骨髓和外周血，免疫表型较特异，结合标志性细胞遗传学/分子生物学检测可以确诊。通常具有标 志性的t（11，14）（q1，q32）染色体异位、CCND1 基因与免疫球蛋白重链（immunoglobulin heavy chain,IGH）基因座，引起促进细胞增殖的细胞周期蛋白D1 的过度表达，最终导致细胞周期紊乱和侵袭性淋巴瘤的形成。作为B 细胞淋巴瘤，MCL 表达CD19、CD20、CD21、CD22、CD79a、表面Ig（通常为IgM 和IgD）、FMC-7、B 淋巴细胞瘤-2 基因（B-cell lymphoma-2,BCL-2）、CD23 和CD200 阴性[2]。CD19 和CD20 之间的表达强弱与CLL 相反，具有一定的鉴别意义。但也有CD23 阳性的报道，Saksena Annapurna 等[14]报告103 例（13%）MCL 患者CD23 弱阳性。CD23+MCL 淋巴瘤患者有白细胞计数增加、骨髓受累和白血病表现。值得注意的是，CD23+MCL 通常与CD200+和弱SOX11 表达相关。尽管CD23+MCL 患者的白血病表现与CLL 相似，但其预后优于CD23-患者。另外，Vockova Petra 等[15]的研究指出CD31 与结外/髓外受累（E/E）的参与程度呈正相关。CD31 的高表达可能促进E/E 组织中MCL 细胞的扩散、植入和/或存活。

1.2 CD5-成熟B 淋巴细胞肿瘤

WHO 定义淋巴浆细胞淋巴瘤（Lymphoplasma‐cytic lymphoma,LPL）是由小B 淋巴细胞、浆细胞样淋巴细胞和浆细胞组成的淋巴瘤，常侵犯骨髓，也侵犯淋巴结和脾脏，且不符合其他可能伴浆细胞分化的小B 细胞淋巴瘤[6]。当LPL 侵犯骨髓且伴单克隆IgM 血症（不论数量）时，则应诊断为华氏巨球蛋白血症（waldenstrfim macroglobulinemia,WM），LPL最重要的特征是具有MYD88 L265P 突变[16]。WM是一种少见的以血清单克隆IgM 为主要特征的惰性淋巴细胞肿瘤[17]。其免疫表型通常为CD19+、CD20+、CD22+、CD25+、CD27+、FMC7+、CD5+/-、CD10-、CD23-、CD103-。10%～20% 的患者 可部分表达CD5、CD10、CD23，此时不能仅凭免疫表型排除WM[18]。可见其淋巴瘤的成分比较复杂，抗原表达上具有高度特异性，表达B 细胞相关抗原有浆细胞成分时可有CD138 的表达。因此，流式细胞术对LPL/WM 有辅助诊断的价值，确诊需要联合单克隆IgM、骨髓形态以及MYD88 基因检测。

滤泡性淋巴瘤（follicular lymphoma,FL）通常是一种由滤泡中心B 细胞转化而成的惰性B 细胞淋巴增生性疾病。FL 的临床表现不具特征性，需经淋巴结病理活检确诊，流式细胞术仅作为辅助诊断方式。几乎所有FL 均为CD19、CD20、CD22、CD79a 和CD10 阳性（60%），且缺乏CD5、CD43（大多数病例）和CD11c 的表达[14,19]。FL 流式细胞术的免疫表型分析通常显示CD10+B 细胞表达单克隆免疫球蛋白轻链，而免疫组织化学通常显示滤泡被CD10+、BCL6+、BCL2+B 细胞占据。在85%～90%的滤泡性淋巴瘤中，疾病进展过程中存在BCL2 重排，导致BCL2 过度表达[1,5]。

毛细胞白血病（hairy cell leukemia,HCL）是一种少见的慢性克隆性B 细胞增殖性疾病，患者多无症状，以贫血、出血、肝脾肿大即外周血及骨髓出现大量边缘不齐呈伪足或纤毛样突出的白细胞为特征[20]。HCL 具有高频率IGHV 突变的克隆B 细胞和较常见的BRAF V600E 突变。因HCL 具有较为独特的免疫表型，其诊断通常通过骨髓活检和流式细胞术。流式细胞术显示HCL 具有高水平的CD19、CD20 和CD22 的表达，同时常表达CD11c、CD103 整合素、CD25 以及CD123，CD5、CD23、CD10 和CD27呈阴性或弱表达[21]。CD11c、CD25、CD103 和CD123可用于区分HCL 和其他B 细胞疾病。其他标记物，如CD27、CD43、CD81 和CD200 在HCL 和HCL-V 中的表达不同，反映其不同的疾病生物学特性[22]。CD27 和CD38 在经典HCL 中通常为阴性，这使其区别于其他淋巴增生性疾病[23]。因毛细胞白血病独特的免疫表型，可利用免疫组织化学（Immunohisto‐chemistry,IHC）和MFC 评估MRD。

B 幼淋巴细胞白血病（B-cell prolymphocytic leu‐kemia,B-PLL）是一种罕见的B 细胞慢性淋巴细胞增生性疾病（B-cell chronic lymphoproliferative dis‐ease,BCLPD），PLL 的显著特征是具有核染色质浓集却有大而明显的单个核仁，特异性的形态结合流式细胞术（flow cytometry,FC）仍然是诊断B-PLL 的可靠方法。PLL 表型特征包括有或没有SIgD、CD19、CD20、CD22、人类白细胞DR 抗原（human leu‐kocyte antigen DR,HLA-DR）、CD79b、FMC7 的表达和克隆型Ig 轻链强表达，但缺少CD5 和CD23 的表达[24]。尽管CLL 和B-PLL 通常能够通过流式细胞术进行区分（最有用的标记物为CD79b、SIgM、CD200、CD27、CD39 和CD5），但与MCL 和B-PLL 的标记物仍有部分重叠。

边缘区淋巴瘤（marginal zone lymphoma,MZL）是惰性B 细胞淋巴瘤，约占非霍奇金淋巴瘤的10%。MZL 的特征是从黏膜相关淋巴组织（mucosa associated lymphoid tissue,MALT）、淋巴结和脾脏中发现B 细胞滤泡边缘区增殖。在最近的WHO 分类中将其分为3 种不同的类型：黏膜相关淋巴组织结外边缘区淋巴瘤（MALT 淋巴瘤）、脾脏MZL（SMZL）和淋巴结MZL（NMZL）。MALT 淋巴瘤细胞显示泛B 细胞标记，如CD19、CD20 和CD79a，同时淋巴瘤细胞表达边缘带相关抗原CD21 和CD35，而CD5、CD10、CD23 和细胞周期蛋白D1 呈阴性表达，这有助于区 分MZL 与CLL/SLL、FL 和MCL。然 而，约20%～25%的MZL 可表达CD5[25]，这种抗原的表达通常与淋巴细胞增多和弥漫性骨髓浸润相关，但不影响预后。SMZL 免疫组化显示成熟的B 淋巴细胞表达CD20 和CD79，不表达cyclinD1、CD10 和BCL6。流式细胞术检测到SMZL 细胞为CD24+、CD27+和FMC7+。典型的CD22 和CD11c 染色，但不如其他脾淋巴瘤（SDRPL 或HCL）明亮。CD123 为阴性，在极少数情况下CD103 可能为微弱阳性。免疫组化及流式细胞术均提示膜联蛋白A1 和CD25 为阴性。另外，在流式细胞术和免疫组织化学组中添加CD180 可以更好地对成熟B 淋巴瘤进行分类，其对MZL 的敏感性和特异性分别为75%和90%[26]，这也使CD180 成为MZL 中有用的免疫标记物。此外，高强度的CD180 染色可能有利于诊断起源于脾的淋巴瘤，因为SMZL 和脾脏弥漫红髓小B 细胞淋巴瘤（SDRPL）在流式细胞术中显示出特别高水平的CD180 表达[27]。

1.3 弥漫性大B 细胞淋巴瘤（diffuse large B cell lym⁃phoma，DLBCL）

弥漫性大B 细胞淋巴瘤是最常见的非霍奇金淋巴瘤，具有侵袭性，患者通常表现为淋巴结迅速扩大和全身症状，需要立即治疗。形态学上，DLBCL 的特征是弥漫性浸润中大型细胞，核仁大，细胞质丰富，破坏并抹去受累淋巴结的基本结构[28]。应用流式细胞术分析该肿瘤无特征性免疫表型，DLBCL 通常表达泛B 细胞抗原，包括CD19、CD20、CD22、CD79a 和CD45。大多数细胞也表达表面免疫球蛋白（immunoglobulin,IG）。Espasa Andrea等[29]检测CD71、CD81、CD44 和CD39 在B 细胞淋巴瘤中的表达时指出，CD71 的高表达提示大细胞淋巴瘤，尤其是在CD10 阴性的情况下，CD10 阴性DLBCL 中CD39 高表达，CD10 阳性DLBCL/HGBL 中CD39 低表达。Stacchini Alessandra 等[30]报道了5 例CD56+DLBCL，其起源于生发中心，明显倾向于结外受累。根据他们的发现和文献资料，CD56 表达似乎优先与生发中心起源的B 淋巴瘤相关。尽管FCM 在大B 细胞淋巴瘤中的诊断作用有限，但流式分析可以快速找到组织中的克隆性B 细胞，结合细胞形态和临床侵袭性过程能尽早明确诊断，为部分患者争取治疗的时间。同时，一项系统评价指出DLBCL 中CD30 阳性的表达可能与更高的存活率和更好的预后相关，也为这部分患者提供新的治疗靶点[31]。2017 年WHO 分类要求将弥漫性大B 细胞淋巴瘤，非特殊性分型（DLBCL,NOS）分为生发中心B细胞型（GCB）或非GCB 类型，通过CD20、CD10、bcl-6 和MUM-1（IRF4）的表达与否来确定弥漫大B细胞起源于GCB 还是非GCB。一般认为CD10+/-，BCL-6+，MUM1-为GCB，其余为非GCB[28]。

1.4 伯基特淋巴瘤（burkitt lymphoma，BL）

伯基特淋巴瘤临床侵袭性强，通常以结外受累或急性白血病的形式出现。目前无单一参数能作为诊断的金标准。BL 来源于生发中心B 细胞，其发育依赖于MYC 基因的表达，该基因编码c-myc 蛋白转录因子，该转录因子位于染色体8q24 上并调节细胞增殖、分化和凋亡[32]。组织学上，BL 通常呈弥漫的生长方式，BL 表现出“满天星”图像，瘤细胞间有散在的组织细胞分布。通常能观察到较高的增殖率和细胞凋亡率，即高分裂指数和高凋亡的特征性病变。免疫表型检测，BL 细胞表达膜IgM，有轻链限制性以及B 细胞相关标志（CD19、CD20、CD22等）和生发中心标志（CD10、BCL6）。CD38、CD43 的阳性率也较高。几乎全部的BL 强表达MYC 蛋白（所有细胞），高增殖活性KI67 大于90%。肿瘤细胞通常不表达CD5、CD23、CD138、BCL2 和TdT[33]。流式细胞术能快速得到结果，结合形态学表现大致可以推断BL 的诊断，为高度进展患者及时治疗提供有力的证据。

2 总结与展望

淋巴瘤是一类高度异质性的肿瘤，其临床表现差异大，对于大多数血液系统恶性肿瘤，形态学/细胞学特征的知识对于巩固综合诊断和指导进一步的细胞遗传学和分子研究是非常重要的，流式细胞术更是诊断各种样本中血液系统肿瘤的一种快速有效的工具，也是建立B 细胞克隆性最方便、最有力的手段之一，因此，以临床为基础的多学科综合诊断治疗是未来淋巴瘤诊治的发展方向。