hsa_circ_0001322在胃癌组织中的表达及其临床意义

武文一，白永愉，庄晓鹏，蔡一奇，周珠哈，阮小蛟

温州医科大学附属第一医院 胃肠外科，浙江 温州 325015

环状RNA（circular RNA,circRNA）是一种内源性非编码RNA，通过反式剪接使3’端和5’端共价结合形成闭合的环状结构，具有高度稳定性、生物进化保守性和组织表达特异性[1-2]。许多研究表明，circRNA不仅在转录翻译等生物学进程中扮演重要角色[3-4]，且与肿瘤等多种疾病相关，影响癌细胞的增殖、分化、凋亡及转移[5-10]。circRNA通过多种机制发挥作用，目前主流观点认为circRNA的主要功能是通过作为微小RNA（microRNA,miRNA）的分子海绵来实现，通过影响miRNA的表达，导致miRNA靶基因的变化[5，11]。胃癌是我国常见的恶性肿瘤，是世界第三大癌症死亡原因[12]，有易转移、预后差等特点，而circRNAs在胃癌的进展中起到了重要调节作用。hsa_circ_0001322由EIF4E3基因的外显子3-8反向剪接形成，我们前期研究发现hsa_circ_0001322在胃癌组织中表达明显降低，但其与胃癌临床病理特征的关系尚未见报道。本研究采用实时定量聚合酶链反应（real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR）对54例胃癌组织及配对癌旁正常胃黏膜组织hsa_circ_0001322的表达水平进行检测，分析其与胃癌临床病理特征的关系，探讨其在胃癌发生发展中的作用。

1 材料和方法

1.1 主要材料和仪器 TRIzol试剂和RNase-free water购自美国Life Technologies公司；5×Prime Script RT Master Mix和SYBR qPCR Master Mix购自日本Takara公司；RT-qPCR仪购自德国 Analytikjena公司。

1.2 方法

1.2.1 标本收集：选取2019年10月至2020年4月在温州医科大学附属第一医院胃肠外科行手术治疗的胃癌患者54例，年龄44～82（72.0±4.7）岁。再选取2020年2月至2020年5月我院胃癌患者24例作为验证集，年龄54～76（69.4±3.1）岁。所有患者术前未行放、化疗等治疗，组织病理类型及分期的判断由本院病理科医师按世界卫生组织胃癌的组织学分型国际分类法（1979年）和美国癌症联合会第八版标准出具病理报告。每例标本留取肿瘤组织及对应的距肿瘤6 cm以上的癌旁正常胃黏膜组织，离体后10 min内置于液氮保存待做后续分析。本研究经本院伦理委员会批准。

1.2.2 总RNA提取：取适量组织进行液氮研磨（研钵先高压高温灭菌处理），将粉末转移至预先装有1 mL TRIzol的EP管中，充分震荡混匀。取0.2 mL氯仿于上述EP管中，充分震荡3 min，冰上静置 5 min，4 ℃离心12 000 r/min，15 min。吸取上层水相至新的RNase-free EP管中，加入0.6 mL异丙醇，混匀，-20 ℃放置30 min。置入离心机，12 000 r/min， 4 ℃离心30 min，弃上清液，观察是否有沉淀。沿管壁加入1 mL预冷的75% DEPC水配制乙醇，轻轻上下颠倒，洗涤离心管。再次置入离心机4 ℃， 7 500 r/min，离心5 min，弃去液体（尽量吸干）。室温干燥5 min，加入40 μL RNase-free水溶解，230 nm处检测RNA浓度，-80℃保存。

1.2.3 RT-qPCR检测：采用RT-qPCR方法，以GAPDH 作为内参，分析hsa_circ_ 0001322表达，相关引物序列见表1。2 μg总RNA分别以hsa_circ_0001322及GAPDH引物进行反转录，反应条件为：37 ℃ 15 min， 85 ℃ 5 min，反应结束后4 ℃保存。以20 μL反应体系进行RT-qPCR。检测反应体系包括：10 μL SYBR qPCR Master Mix，0.5 μL circRNA特异前向引物、0.5μL特异反向引物，1 μL cDNA，8 μL ddH2O。RT-qPCR条件为：在95 ℃下预变性5 min，然后在 95 ℃下30 次变性30 个循环，60 ℃退火30 s，在 72 ℃延伸30 s，最后延伸在72 ℃下放置7 min。所有样品做两个复孔。记录每个反应管中的荧光信号到达所设定的域值时所经历的循环数即Ct值，以GAPDH作为内参照，采用RT-qPCR中的相对定量法，以2-ΔΔCt表示肿瘤组织目的基因的表达相对于配对的癌旁正常胃黏膜组织的变化倍数，其中ΔΔCt= （Cthsa_circ_0001322-CtGAPDH）肿瘤-（Cthsa_circ_000132-CtGAPDH）正常。癌旁正常胃黏膜组织的基因表达值为1。

表1 circRNA RT-qPCR检测相关引物序列

1.3 统计学处理方法 采用SPSS23.0软件进行分析。hsa_circ_0001322相对表达值不符合正态分布，以M（P25，P75）表示，胃癌及配对癌旁正常胃黏膜组织间比较采用配对Wilcoxon符号秩检验比较，两独立样本间的比较采用Mann-WhitneyU检验，多组间比较采用Kruskall-Wallis检验。采用偏相关分析探讨胃癌组织hsa_circ_0001322的表达量（相对于GAPDH的ΔCT值，经检验符合正态分布）在去除各影响因素后与淋巴结转移的相关性。采用受试者工作特征曲线（receiver operator characteristic curve,ROC曲线）分析胃癌组织中hsa_circ_0001322的相对表达量对判断胃癌组织有无淋巴结转移的效能。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 胃癌及配对癌旁正常胃黏膜组织中hsa_circ_ 0001322的表达 RT-qPCR结果表明，与配对癌旁正常胃黏膜组织比较，胃癌组织中的hsa_circ_ 0001322相对表达量明显降低，差异有统计学意义 （P＜0.05）。见图1。

图1 hsa_circ_0001322在胃癌组织相对癌旁正常胃黏膜组织的表达情况

2.2 hsa_circ_0001322表达与胃癌临床病理特征的关系 高分化组的胃癌组织中hsa_circ_0001322的相对表达量明显高于低分化组，无淋巴结转移组中hsa_circ_0001322的相对表达量明显高于有淋巴结转移组（P＜0.05）。另外，不同年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤部位、浸润深度、淋巴结转移分期及TNM分期间胃癌组织中hsa_circ_0001322的相对表达量差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表2 胃癌中hsa_circ_0001322表达和临床病理特征的关系

2.3 hsa_circ_0001322与胃癌淋巴结转移的相关性分析 胃癌的淋巴结转移受患者年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤部位、肿瘤浸润深度、细胞分化程度等多因素影响，我们采用偏相关分析排除这些影响因素后判断hsa_circ_0001322是否与胃癌的淋巴结转移状态相关。结果显示，无论患者年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤部位、肿瘤浸润深度和细胞分化程度如何，hsa_circ_0003122的表达量与胃癌的淋巴结转移存在负相关性（r=-0.587，P＜0.05）。

2.4 ROC曲线分析hsa_circ_0001322预测胃癌淋巴结转移的敏感度和特异度 ROC曲线分析结果显示，曲线下面积（area under curve,AUC）为0.808（95%CI=0.684～0.933，P＜0.05），以hsa_circ_ 0001322相对表达量0.254作为截断值判断胃癌有无淋巴结转移的敏感度和特异度分别为90.0%和75.0%，见图2。

图2 hsa_circ_0001322判断胃癌淋巴结转移的效能

为进一步分析hsa_circ_0001322 预测胃癌淋巴结转移的效能，我们另外选取24 例胃癌患者作为验证集，仍以hsa_circ_0001322 相对表达量0.254作为截断值，对胃癌有无淋巴结进行预测并与手术后病理报告（有淋巴结转移14例，无淋巴结转移10例）对比。ROC曲线分析显示，AUC为0.757（95%CI=0.542～0.972，P＜0.05），敏感度和特异度分别为85.7%和80.0%。见图3。

图3 hsa_circ_0001322预测胃癌淋巴结转移的效能

3 讨论

我国是全球胃癌发病率最高的国家，五年存活率仅为27.4%。虽然随着胃镜筛查的普及[13]、手术方式的改良以及辅助放化疗的综合诊治手段的推广，胃癌患者的预后和生活质量已经有了较大的提升[14]，但胃癌的预防和诊治仍面临着许多挑战。胃癌早期患者经及时治疗后的生存率可以达到90%～95%，但是由于此时病灶小、较隐秘，且患者症状不明显，易被误诊或者漏诊，确诊时已发展成中晚期胃癌，所以早期胃癌的诊断意义重大，但是现在对于临床症状不明显，影像学不典型的早期胃癌患者还没有非常经济可靠的检测手段。另外，淋巴结转移是影响胃癌患者预后的重要因素，局部病灶切除加区域淋巴结清扫是治疗胃癌的标准术式。但是淋巴结清扫也伴随着更高的手术并发症发生率以及病死率，并且临床上常常也因淋巴结清扫范围盲目扩大，而严重影响手术疗效。因此准确判断胃癌淋巴结转移是精确手术治疗胃癌的前提，现在主流的影像学分析技术虽已经获得了极大进步，但是仍达不到完全有效的程度，容易漏诊或难以判断[15]，仍亟待其他技术手段的辅助。

随着分子生物学的发展，肿瘤标志物在癌症筛查及诊断中发挥了越来越重要的角色，结合特异性肿瘤标志物的联合诊断方法具有更好的便捷性和更高的准确度。circRNAs是非编码RNA的一种特殊类型，与传统的线性RNA不同，circRNAs因其具有环状结构可以抵抗外切酶和RNA酶的降解，因而在细胞中可以相对稳定存在[16-17]。研究发现circRNAs可以作为分子海绵吸附miRNAs抑制其功能进而调控癌症的发展：如circ-TTBK2通过ceRNA机制调节miR-217/HNF1β/Derlin-1 轴促进神经胶质瘤进展[18]；circEYA3通过海绵作用吸附miR-1294调节c-Myc表达进而促进胰腺导管腺癌的进展[19]；circCCDC9通过调节miR-6792-3P/CAV1轴抑制胃癌的进展[20]。同时MA等[21]报道hsa_circ_0004872通过调节miR-224/Smad4/ADAR1通路影响胃癌的淋巴结转移。另外cicrRNA的表达具有非常强的组织特异性，同时其在直肠癌、肝癌以及胰腺癌等癌症中都表现出明显的异常表达现象[22]。以上功能特征使得cicrRNA具有作为有效诊断癌症的特异性标志物的潜力。

本研究检测了54 例胃癌患者的胃癌组织以及配对的癌旁正常胃黏膜组织中的hsa_circ_0001322的表达情况。有趣的是54 例胃癌患者的胃癌组织相对于癌旁正常胃黏膜组织中hsa_circ_0001322的表达量皆出现了明显下降，同时临床病理特征关联分析表明其下降在胃癌的各种病理特征分类下都具有一致性，说明此下降现象与胃癌病变有直接的强关联。这说明癌变的发生会伴随着组织中hsa_circ_0001322表达量的下降，且这种变化趋势的稳定性较好。这些变化特征使得hsa_circ_0001322具有作为胃癌诊断的生物标志物的潜力。通过病理特征关联分析发现在是否发生淋巴结转移的病例分组中hsa_circ_0001322的相对表达量差异有统计学意义，另外除分化程度外，其他病理特征分组的hsa_circ_0001322相对表达量差异无统计学意义，说明其在胃癌组织中的进一步变化与淋巴结转移具有相关性，进一步偏相关分析结果显示排除患者年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤部位、肿瘤浸润深度和细胞分化程度后，hsa_circ_0003122的表达量与胃癌的淋巴结转移存在负相关性。hsa_circ_0001322这种变化特征使得它具有作为指示胃癌细胞淋巴结转移生物标志物的潜力。ROC曲线分析结果显示，AUC为0.808，当hsa_circ_0001322的相对表达量为0.254时，其预测淋巴结转移的敏感度和特异度分别为90.0%和75.0%；本研究继续选取24例胃癌患者验证ROC曲线的效能，其AUC为0.757，敏感度和特异度分别为85.7%和80.0%，其在预测胃癌淋巴结转移方面可能具有一定的潜力。

但是本研究尚有一些需要完善的地方，首先我们是从病理样本中检测hsa_circ_0001322的表达变化，这在一定程度上限制了检测的便捷性，可以进一步统计分析血清中hsa_circ_0001322的表达变化，以观察其规律。其次，临床病例分析发现多种生物标志物联合使用，可以增加预测的准确度，我们可以进一步探索hsa_circ_0001322与其他生物标志物，如SLP1、PG等，联合分析是否可以增加预测淋巴结转移的准确度。再次本研究的样本量较少，如针对更广泛的患者，这种规律是否会保持一致，也需要探讨的问题。