山楂叶提取物磷脂复合物的制备及其理化性质研究

王媛媛,曹杰楠,夏梦莹,严国俊,潘金火

(南京中医药大学药学院,江苏 南京 210023)

山楂叶为蔷薇科植物山里红CrataeguspinnatifidaBge. var. major N. E. Br.或山楂CrataeguspinnatifidaBge的干燥叶,具有活血化瘀、理气通脉、化浊降脂的功效[1],临床上,常用于心脑血管疾病的治疗。山楂叶中主要含有黄酮类成分、有机酸类成分、微量元素和含氮化合物等,其中黄酮类化合物主要为牡荆素鼠李糖苷、牡荆素葡萄糖苷等,对缺血再灌注损伤(脑缺血、心肌缺血、肺缺血、肾缺血)有保护作用,具有抗动脉粥样硬化、保肝、降糖、降脂、降压作用等[2-3]。但由于山楂叶提取物具有高水溶性与低渗透性的特点,口服生物利用度较低,有必要制备高效制剂改善山楂叶提取物的溶解性,提高其临床应用和价值。

磷脂复合物是药物和磷脂通过电荷迁移作用而形成的较为稳定的化合物,磷脂具有亲水性和亲脂性的特点,与人体生理系统具有相似性。黄酮类化合物结构中电负性较强的部位在一定条件下与磷脂带正电荷的极性端通过氢键或分子间作用力结合形成多层囊状磷脂复合物,改善黄酮类药物的脂溶性[4]。本实验将山楂叶提取物制备成磷脂复合物,优化其制备方法,对其理化性质进行研究,以期增强其脂溶性,进一步提高口服生物利用度。

1 材料

1.1 仪器

Waters2695高效液相色谱仪(美国Waters公司);MS-105DU型电子分析天平(梅特勒-托利多国际股份有限公司);Biosafer SB25-12DTD超声波清洗机(赛飞中国有限公司);ZEISS SUPRA 40型扫描电子显微镜(德国蔡司公司);Nicolet-iS 10型傅里叶变换红外光谱仪(美国赛默飞公司);Bruker D8型X射线衍射仪(德国布鲁克公司);UV-2401PC型紫外可见分光光度计(日本岛津公司);85-2型恒温磁力搅拌器(江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司);DKZ-2型恒温水浴振荡器(上海精宏实验设备有限公司)。

1.2 试药

山楂叶提取物(批号:FY20S0309,以芦丁计总黄酮>80%)购自南通飞宇生物科技有限公司;大豆磷脂(批号:RH233191,纯度90.0%)购自上海易恩化学技术有限公司;牡荆素葡萄糖苷对照品(批号:20042305,纯度99.79%),牡荆素鼠李糖苷对照品(批号:20042304,纯度99.80%),牡荆素对照品(批号:18052906,纯度≥98%),芦丁对照品(批号:20200803,纯度97.0%),金丝桃苷对照品(批号:19103001,纯度98.35%)均购自南京金益柏生物科技有限公司;乙腈、四氢呋喃为色谱纯,乙酸为分析纯,实验用水为怡宝纯净水。

2 方法与结果

2.1 山楂叶提取物磷脂复合物含量测定方法的建立

2.1.1 混合对照品溶液的制备 取牡荆素葡萄糖苷、牡荆素鼠李糖苷、牡荆素、芦丁、金丝桃苷对照品适量,精密称定,加60%乙醇制成含141、311、9.68、10.9、10.6 μg·mL-1的溶液,即得混合对照品储备液。

2.1.2 供试品溶液的制备 取山楂叶提取物磷脂复合物50 mg,精密称定,置10 mL量瓶中,加60%乙醇溶解并稀释至刻度,充分溶解,经0.45 μm微孔滤膜滤过,取续滤液,即得。

2.1.3 色谱条件 色谱柱:Waters Symmetry C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);柱温:30 ℃;流速:1.0 mL·min-1;流动相:乙腈(A)-0.5%乙酸水溶液(B)-四氢呋喃(C);分析时间:50 min;进样量:10 μL;检测器:Waters 2998二极管阵列检测器;检测波长:330 nm;梯度洗脱:0～5 min,10%～12%A,90%～88%B;5～15 min,12%～12%A,88%～88%B;15～20 min,12%～12%A,88%～84%B,0～4%C;20～35 min,12%～12%A,84%～84%B,4%～4%C;35～40 min,12%～30%A,84%～66%B,4%～4%C;40～45 min,30%～10%A,66%～90%B,4%～0C;45～50 min,10%～10%A,90%～90%B。混合对照品、供试品及大豆磷脂HPLC图见图1。

注：1.牡荆素葡萄糖苷;2.牡荆素鼠李糖苷;3.牡荆素;4.芦丁;5.金丝桃苷图1 供试品(A)、混合对照品(B)和大豆磷脂(C)HPLC图Fig. 1 HPLC chart of test sanple(A), mixed reference (B) and soybean phospholipid (C)

2.1.4 方法学考察

2.1.4.1 线性关系考察 精密吸取混合对照品储备液,逐级稀释,按“2.1.3”项下色谱条件测定记录峰面积,以进样浓度(μg·mL-1)为横坐标(X),以峰面积为纵坐标(Y)进行线性回归,得到牡荆素葡萄糖苷、牡荆素鼠李糖苷、牡荆素、芦丁、金丝桃苷回归方程及线性范围,结果见表1。

表1 各成分的回归方程、线性范围及相关系数Table 1 Regression equation, linear range and correlation coefficient of each component

2.1.4.2 精密度试验 取混合对照品溶液,按“2.1.3”项下色谱条件连续进样6次,结果显示牡荆素葡萄糖苷、牡荆素鼠李糖苷、牡荆素、芦丁和金丝桃苷峰面积的RSD分别为0.45%、0.24%、1.01%、1.06%、0.79%,表明仪器精密度良好。

2.1.4.3 稳定性试验 取山楂叶提取物磷脂复合物供试品溶液,分别于0、2、4、6、8、10、12、24 h进样,结果显示牡荆素葡萄糖苷、牡荆素鼠李糖苷、牡荆素、芦丁和金丝桃苷峰面积的RSD分别为0.38%、0.47%、4.56%、4.07%、5.48%,表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.1.4.4 重复性试验 取山楂叶提取物磷脂复合物6份,精密称定,分别按“2.1.2”项下供试品溶液制备方法制备供试液,再按“2.1.3”项下色谱条件各进样1次,结果显示牡荆素葡萄糖苷、牡荆素鼠李糖苷、牡荆素、芦丁和金丝桃苷含量的RSD分别为1.06%、1.44%、1.97%、1.71%、4.56%,表明该方法重复性良好。

2.1.4.5 加样回收率试验 取已知含量的山楂叶提取物磷脂复合物6份,每份供试品中加入各成分含量100%的对照品,按“2.1.2”项下供试品制备方法制备溶液,再按“2.1.3”项下色谱条件各进样1次,计算加样回收率。结果为牡荆素葡萄糖苷的平均回收率为96.19%,RSD为2.83%;牡荆素鼠李糖苷的平均回收率为94.53%,RSD为2.90%;牡荆素的平均回收率为107.49%,RSD为3.37%;芦丁的平均回收率为109.90%,RSD为1.55%;金丝桃苷的平均回收率为94.64%,RSD为2.36%。

2.2 质量权重系数的计算方法

质量权重系数是指各代表性成分在总成分中的重要程度。山楂叶提取物中黄酮组分各成分之间存在特定的量比关系,直接影响黄酮组分的理化性质和生物药剂学特性。总成分中各代表性成分的质量权重系数可以看作各成分在总成分中所占的比例[5-6],即:

δi=Wi/W总(δi为某代表性成分的质量权重系数;Wi为总成分中某代表性成分的质量分数;W总为总成分的质量分数)。

总成分某一理化性质综合值(如药物油水分配系数的综合值):

根据山楂叶提取物含量测定结果,山楂叶提取物黄酮组分中的牡荆素葡萄糖苷、牡荆素鼠李糖苷、牡荆素、芦丁、金丝桃苷的质量分数Wi分别为2.38%、9.42%、0.16%、0.17%、0.18%,总成分的质量分数为W总=12.31%,则各成分的质量权重系数δi依次为0.193 3、0.765 2、0.013 0、0.013 8、0.014 6。

2.3 磷脂复合物的制备及复合率的测定

2.3.1 山楂叶提取物磷脂复合物的制备 取山楂叶提取物与大豆磷脂置于圆底烧瓶中,加入复合溶剂,置于恒温磁力搅拌器上,在一定温度下复合一定时间,减压回收复合溶剂,收集沉淀物,减压干燥,即得山楂叶提取物磷脂复合物。

2.4 单因素考察

2.4.1 复合溶剂的考察 选定山楂叶提取物与大豆磷脂的药脂比1∶3,药物的质量浓度为2 mg·mL-1,在50 ℃温度下复合2 h。以组分复合率为评价指标,对无水乙醇、甲醇、四氢呋喃、三氯甲烷、乙酸乙酯进行考察,结果分别为64.38%、37.86%、8.05%、8.94%、5.13%;以质量复合率为评价指标,则考察结果分别为71.98%、56.22%、30.05%、32.51%、21.08%。结果表明,无水乙醇作为复合溶剂时,组分复合率和质量复合率较高,且差异显著,故选用无水乙醇作为复合溶剂。

2.4.2 药脂比的考察 选定山楂叶提取物与大豆磷脂的复合溶剂为无水乙醇,药物的质量浓度为2 mg·mL-1,在50 ℃温度下复合2 h。以组分复合率为评价指标,对山楂叶提取物与大豆磷脂的药脂比为1∶1、1∶3、1∶5、1∶7进行考察,结果分别为40.02%、62.42%、59.99%、29.90%;以质量复合率为评价指标,则考察结果分别为61.84%、76.19%、73.45%、69.19%。结果表明,随着磷脂的增加,复合率增高,但过多的磷脂则会导致复合率低。

2.4.3 复合温度的考察 选定山楂叶提取物与大豆磷脂的复合溶剂为无水乙醇,药脂比为1∶3,药物的质量浓度为2 mg·mL-1,复合时间2 h。以组分复合率为评价指标,对复合温度30、40、50、60 ℃进行考察,结果分别为49.05%、64.83%、66.37%、63.43%;以质量复合率为评价指标,则考察结果分别为62.75%、70.65%、71.96%、72.86%。结果表明随着复合温度的升高,复合率增高,超过40 ℃后复合率变化不大。

2.4.4 药物质量浓度的考察 选定山楂叶提取物与大豆磷脂的复合溶剂为无水乙醇,药脂比为1∶3,在50 ℃温度下复合2 h。以组分复合率为评价指标,对药物质量浓度1、2、3、4 mg·mL-1进行考察,结果分别为67.69%、66.37%、54.57%、57.77%;以质量复合率为评价指标,则考察结果分别为80.80%、71.96%、65.78%、65.33%。结果表明随着药物质量浓度的提高,复合率降低。

2.4.5 复合时间的考察 选定山楂叶提取物与大豆磷脂的复合溶剂为无水乙醇,药脂比为1∶3,药物的质量浓度为2 mg·mL-1,在50 ℃温度下复合一定时间。以组分复合率为评价指标,对复合时间1、2、3、4 h进行考察,结果分别为57.60%、60.06%、57.73%、60.22%;以质量复合率为评价指标,则考察结果分别为68.16%、73.74%、73.60%、75.00%。结果表明复合时间对复合率影响较小,超过1 h后复合率变化不大。

2.5 正交法优化山楂叶提取物磷脂复合物制备方法

根据单因素试验考察结果,选择最佳复合溶剂为无水乙醇,复合1.5 h,复合率受山楂叶提取物与大豆磷脂的比例(A)、复合温度(B)、药物质量浓度(C)的影响较大。因此,采用L9(34),对ABC做三因素三水平的正交试验,以组分复合率和质量复合率为评价指标,综合评分=组分复合率×50%+质量复合率×50%(评分选择依据制备过程中评价指标的重要性差异经验确定),因素水平见表2,试验设计及结果见表3～5。

表2 因素水平表Table 2 Factors and levels

表3 正交试验各成分复合率结果(%)Table 3 The results of the compound rate of each component in the orthogonal test (%)

结果表明,C因素(药物质量浓度)对复合率有显著性影响,各因素对复合率影响次序分别为药物质量浓度(C)、药脂比(A)、复合温度(B),结合直观分析,最佳制备方法为A3B3C1。为节约辅料,最终确定山楂叶提取物与大豆磷脂的投料比例为1∶4,山楂叶提取物的浓度为1 mg·mL-1,于60 ℃温度下复合1.5 h为最佳制备方法。

表4 正交试验直观分析结果Table 4 Intuitive analysis results of orthogonal test

表5 方差分析Table 5 Variance analysis

2.6 验证试验

对最佳制备方法进行验证试验,重复3次,结果得到山楂叶提取物磷脂复合物的平均组分复合率为68.32%,RSD为0.29%;平均质量复合率为86.31%,RSD为1.30%,表明制备方法稳定合理。结果见表6。

表6 正交验证试验复合率结果(%)Table 6 Compound rate results of orthogonal verification test (%)

2.7 山楂叶提取物磷脂复合物的表征

2.7.1 扫描电子显微镜分析 分别取山楂叶提取物、大豆磷脂、物理混合物和磷脂复合物适量于导电胶上,真空镀金后于扫描电子显微镜下分别观察样品的表面形态。结果见图2,山楂叶提取物原料药表面光滑,呈条状或块状,具有一定的晶体形态;大豆磷脂表面光滑,呈球状或类球状,为无定形状态;物理混合物表面凹凸不平,也呈球状或类球状;而磷脂复合物表面光滑,呈无规则的块状,其形态发生了明显的变化,显然不同于其他三者,山楂叶提取物和大豆磷脂作用成为无定形状态。

2.7.2 紫外吸收光谱分析 分别取山楂叶提取物、大豆磷脂、物理混合物、磷脂复合物适量,加60%乙醇定容至一定体积,以60%乙醇溶液为空白,于190～400 nm波长范围内测定吸光度并绘制曲线。结果见图3,山楂叶提取物、物理混合物和磷脂复合物均在约330、270、210 nm处有吸收峰,且光谱图相似,而磷脂在此处几乎没有吸收,表明山楂叶提取物和大豆磷脂在复合过程中没有形成新的发色团,即未形成新的物质。

注：A.山楂叶提取物;B.大豆磷脂;C.物理混合物;D.磷脂复合物图2 不同样品扫描电镜图Fig. 2 Scanning electron micrographs of different samples

2.7.3 红外吸收光谱分析 分别取山楂叶提取物、大豆磷脂、物理混合物、磷脂复合物适量,加入溴化钾后进行研磨和压片,在4 000～400 cm-1范围内进行红外扫描。结果见图4,物理混合物图谱具备山楂叶提取物和大豆磷脂的图谱特征,磷脂复合物图谱与物理混合物大体相似。大豆磷脂、物理混合物、磷脂复合物中均在2 925、2 854、1 740、1 379 cm-1处有特征峰,说明大豆磷脂中脂肪酸链的亚甲基C—H键、脂肪酸酯的C=O键并未参与复合过程;4种样品均在1 064 cm-1处有吸收峰,即大豆磷脂和山楂叶提取物中的C—O键均未参与复合过程;大豆磷脂的P=O表现在1 234 cm-1,磷脂复合物的P=O表现在1 216 cm-1处,即向低波数位移,山楂叶提取物的OH表现在3 379 cm-1,磷脂复合物的OH表现在3 361 cm-1,即向低波数位移,原因可能在于大豆磷脂的P=O与山楂叶提取物的OH发生作用[8-9]。磷脂复合物中山楂叶提取物与大豆磷脂的基本化学结构没有发生根本的改变,既未生成新的化合物,也非物理混合,表明磷脂复合物中山楂叶提取物与大豆磷脂可能以分子间作用力结合形成无定形态。

注：A.山楂叶提取物；B.大豆磷脂；C.物理混合物；D.磷脂复合物图4 不同样品红外光谱图Fig. 4 Infrared spectra of different samples

2.7.4 X射线衍射分析 分别取山楂叶提取物、大豆磷脂、物理混合物、磷脂复合物适量,平铺于石英槽,轻轻压平,以Cu靶为发射器,在电压40 kV,电流40 mA,步距0.02°,衍射角度为5°～90°的条件下进行分析。结果见图5,山楂叶提取物在扫描范围5°～90°中存在多个尖锐的衍射峰。大豆磷脂无衍射峰,表明大豆磷脂主要以无定形状态存在。物理混合物中存在少量衍射峰且具有无定形特征,其图谱是两者图谱的叠加,但衍射峰的强度降低,表明物理混合过程中药物和磷脂无相互作用发生。磷脂复合物无衍射峰,以无定形态存在,可能由于成分与磷脂结合后山楂叶提取物的晶型特征受到抑制。

注：A.物理混合物；B.大豆磷脂；C.山楂叶提取物；D.磷脂复合物图5 不同样品X-衍射分析图谱Fig. 5 X-Diffraction analysis patterns of different samples

2.8 山楂叶提取物磷脂复合物的表观油水分配系数研究

取山楂叶提取物和磷脂复合物适量,精密称定,置于10 mL容量瓶中,加正辛醇饱和的水、不同pH水溶液定容至刻度,配制成初始水溶液,经0.45 μm微孔滤膜滤过后,取续滤液进样检测各成分浓度(C0)。取上述水溶液2 mL,置于10 mL具塞试管中,分别加入水及不同pH缓冲液饱和的正辛醇溶液2 mL,放入水浴恒温振荡器在(37±1)℃下振摇24 h至平衡。分取下层水相,经0.45 μm微孔滤膜滤过后,取续滤液进样检测各成分浓度(C)。按P=(C0V0-CV)/CV计算山楂叶提取物中各成分的表观油水分配系数P,结果见表7～8。

表7 山楂叶提取物各成分的油水分配系数Table 7 Oil-water partition coefficient P of each component of hawthorn leaf extract

表8 山楂叶提取物磷脂复合物各成分的油水分配系数Table 8 Oil-water partition coefficient P of each component of hawthorn leaf extract phospholipid complex

根据各成分在正辛醇-水及不同pH的磷酸盐缓冲液系统的表观油水分配系数,按照“2.2”项下公式计算山楂叶提取物和磷脂复合物黄酮组分的表观油水分配系数综合值,如山楂叶提取物黄酮组分在正辛醇-pH5.0磷酸盐缓冲液系统中的表观油水分配系数C=0.193 3×0.107 6+0.765 2×0.189 5+0.013 0×0.708 2+0.013 8×2.414 2+0.014 6×3.280 0=0.256 2,其他以此类推,结果见图6。结果表明,在pH5.0、pH5.8、pH6.8、pH7.0和水的条件下,磷脂复合物的表观油水分配系数明显高于山楂叶提取物,说明山楂叶提取物制备成磷脂复合物后脂溶性得到了改善。

图6 质量权重系数法所得油水分配系数比较Fig. 6 Comparison of oil-water distribution coefficient obtained by mass weight coefficient method

3 讨论

黄酮类化合物大量存在于植物界中,且具有广泛的药理作用,但有些黄酮类化合物具有的理化性质(溶解性或渗透性差)导致其口服生物利用度较低,限制其疗效的发挥,通过中药现代制剂技术改善药物性质显得尤为重要。磷脂复合物能通过改善水溶性药物的脂溶性从而增加药物在胃肠道的吸收[10],本实验基于磷脂复合物与黄酮类化合物较好的亲和力,制备山楂叶提取物磷脂复合物以改善母体药物的理化性质。

课题组前期溶解度试验结果表明山楂叶提取物水溶性较好,能溶解于水、甲醇、乙醇、四氢呋喃等极性较大的溶剂中,在乙酸乙酯、三氯甲烷、二氯甲烷等极性较小的溶剂中几乎不溶,故期望通过制剂学手段改善其理化性质。本实验采用单因素考察和正交设计试验将山楂叶提取物制备成磷脂复合物,制备工艺合理可靠,总体复合率较高。对于单个成分,芦丁和牡荆素鼠李糖苷的复合率较其他成分高,原因可能在于芦丁结构中羟基较多,更容易和大豆磷脂的极性端形成氢键,而牡荆素鼠李糖苷是山楂叶提取物中含量最高的成分,与大豆磷脂结合的机会更多,且有较多羟基,故复合率较高。本实验采用扫描电镜、红外光谱、紫外光谱、X-衍射和表观油水分配系数法对山楂叶提取物磷脂复合物进行理化性质研究,结果表明磷脂复合物为无定形状态,表观油水分配系数较山楂叶提取物得到提高,脂溶性得到了改善,为后期口服生物利用度实验奠定了基础。

国内外多以单体黄酮类成分制备磷脂复合物,由于中药成分的复杂性,中药有效部位的制剂构建需要新的思路与方法。本研究以中药组分为核心,采用质量权重系数法表征山楂叶提取物中黄酮组分的整体性质,避免单一成分的独立性质和多成分性质简单加和的缺陷，以期为中药组分生物药剂学性质研究和中药提取物剂型改善研究提供研究思路与参考[5]。