液相色谱法测定酱腌菜中糖精钠含量的不确定度评定

李 贤 单慧燕 曹明月 兰 剑 赵景丽 兰尊海

（河南海瑞正检测技术有限公司,河南 郑州 450001）

酱腌菜的生产历史悠久，酱腌菜以各种当季的菜果作为原材料，通过各种特殊的工艺制作而成，其种类根据工艺不同而不同[1-3]。根据中华人民共和国国内贸易行业标准SB/T 10439—2007《酱腌菜》[4]，酱腌菜被分为虾油渍菜、糟渍菜等9个不同类别。

食品添加剂在现代食品工业中起着十分重要的作用，适当使用食品添加剂可以改善食品的口感、防止腐败变质、方便食品加工等。生产酱腌菜的厂家为了达到提高产品风味的目的，也常会使用食品添加剂，尤其是一些甜味剂。通过查阅相关文献以及食品监管部门的调查数据可知，在酱腌菜中食品添加剂超标现象比较严重[5-10]。依据我国现行的国家安全限量指标的规定，糖精钠在酱腌菜中的最高限量为0.15 g/kg[11]。糖精钠是合成甜味剂的一种，蔗糖甜度是糖精钠甜度的1/300～1/500，糖精钠结构比较稳定，不太容易被人体吸收，毒性虽然不强，但是存在一定的致癌性[12-14]。

因此，酱腌菜中糖精钠测定结果的准确度显得特别重要。根据中华人民共和国计量校准规范JJF 1059.1—2012[15]、中国合格评定委员会相关要求CNAS-GL006:2018[16]、酱腌菜中糖精钠的检测国家标准[17]等，采取液相色谱法对影响检验检测结果的不确定度分量进行评定和量化，酱腌菜中糖精钠检测结果临界值的出现，为检测结果的判定提供了更加客观的依据。

1 实验

1.1 仪器与试剂

Waters2695高效液相色谱仪（美国沃特世）；BT25S分析天平（梅特勒）；3K-15离心机（SIGMA（扬州）有限公司）；多管振荡器（北京优晟）；D-160匀浆机（美国SCILOGEX）；KQ-250D数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；0.22 μm水相微孔滤膜；糖精钠（标准品，BePure）；乙酸铵、甲醇，甲酸（色谱纯，美国Sigma公司）；其他试剂均为分析纯。

1.2 样品前处理

本次样品选用的酱腌菜为酸黄瓜，购置于本地超市。将试样经匀浆机处理后，称取2 g（精确到0.001 g）样品放置在离心管中，加入实验室三级水25 mL，置于混匀器中进行混合。将超声波清洗器温度设置为50 ℃，超声处理20 min。将样品拿出放置至室温后，分别加入2 mL的亚铁氰化钾溶液和乙酸锌溶液，混合均匀并离心，设置速度为8000 r/min，高速离心5 min后取出。将溶液转移到容量瓶中，用适量的三级水对残渣进行洗涤后合并洗涤液至容量瓶中，按上述步骤混匀离心后，摇匀，过滤后即可上机测定。

1.3 糖精钠标准溶液的配制

糖精钠标准贮备液：准确称取经120 ℃烘干4 h，于干燥器中冷却至室温的糖精钠适量（精确到0.0001 g），加入适量三级水进行溶解后定容到100 mL容量瓶中，制成浓度为1000 mg/L的贮备液摇匀备用。然后经过一系列的稀释之后配制成浓度为0～200 mg/L的标准上机曲线溶液。稀释所用的溶剂均为三级水，所用的玻璃器具均为A级。

1.4 液相色谱测定条件

参照检测标准中的仪器条件采取碳18的色谱柱；流动相采用乙酸铵溶液和甲醇比例为95:5；流速设置为1 mL/min；检测波长设置为230 nm；进样量为10 μL。

2 数学模型的建立

酱腌菜中糖精钠的计算公式如下：

式中：X为待测试的样品中甜味剂糖精钠的含量，g/kg；V为待测试的样品样液的定容体积，mL；ρ为待测试的样品溶液中甜味剂糖精钠的浓度，mg/L；m为待测试的样品的称样质量，g。

3 不确定度的主要来源

根据该检测方法前处理过程及数学模型分析，酱腌菜中糖精钠测定不确定的主要来源为：人员操作、样品制备均匀性和方法的重复性、环境条件、样品称量、标准溶液及制备过程、样品定容和稀释及所用设备精密度带来的不确定度。其中A类不确定度来源包括检测的重复性、人员操作、试样制备的代表性及均匀程度等等带来的不确定度，B类不确定度的主要来源为：所用设备设施的精密度、检测环境温度控制、所使用的标准物质的纯度、配制过程及标准曲线的拟合过程等等。

4 不确定度的评定

4.1 A类不确定度的评定

A类不确定度来源包括检测的重复性、人员操作、试样制备的代表性及均匀程度等带来的不确定度，在遵守标准方法规定的条件下，可以通过统计学的方法来评价其不确定度，通过测试结果的重复性体现其不确定度。

4.1.1 结果重复性

定义结果重复性标准不确定度为u（X），重复性相对标准不确定度为Urel（X），本次实验对待检测试样中甜味剂糖精钠含量进行6次重复性试样结果见表1。

根据表1，酱腌菜中的糖精钠含量分别进行6次独立试验结果，得出糖精钠含量的标准偏差为：

表1 酱腌菜糖精钠试样重复性测量情况

则结果重复性标准不确定度为：

结果重复性相对标准不确定度为：

4.2 B类不确定度的评定

B类不确定的主要来源为：所用设备设施的精密度、检测环境温度控制、所使用的标准物质的纯度、配制过程及标准曲线的拟合过程等等。

4.2.1 样品前处理过程带来的不确定度

4.2.1.1 样品称量

定义称量标准不确定度为u（m），称量相对标准不确定度为Urel（m）。根据万分之一电子分析天平校准证书给出的称量扩展不确定度为U=0.23 mg（k=2），依据本次实验当平均称样质量为2.0557 g时，由称量造成的相对标准不确定度为：

4.2.1.2 样品定容

本次实验前处理样液所用容量瓶为A级，体积为50 mL，定义样液前处理步骤体积引入的标准不确定度为u（v），样液前处理步骤体积引入的相对标准不确定度为Urel（v），对体积产生主要影响因素为容量瓶本身容量误差以及环境温度的影响，综合考虑，做出以下分析。

4.2.2 标准物质

4.2.2.1 标准物质含量

本次使用的糖精钠的标准物质购置于坛墨质检，其证书规定的该批次的标准物质的扩展不确定度为1.0%（k=2），因此由于标准物质含量带来的标准不确定度为：

4.2.2.2 标准物质称量

标准物质称量所使用的分析天平精度为十万分之一，由该分析天平的校准证书可知该天平的允许误差为±0.5 mg，假设分布为矩形分布，当标准物质的称样质量为0.117 28 g时，由于称量带来的相对标准不确定度为：

4.2.2.3 标准物质定容稀释

在标准溶液的配制过程中共使用了0.1 mL、0.5 mL、1 mL、2.5 mL、5 mL、10 mL刻 度 管，10 mL、50 mL和100 mL的容量瓶，所有量器均符合查阅JJG196—2006《常用玻璃量器检定规程》中规定的A级标准。本次实验的室温控制在20 ℃±4 ℃的范围之内，假设玻璃容器允差以及混进温度的变化均按照矩形分布来进行考虑，则本次实验中标准溶液的配制过程中玻璃容器以及环境温度条件带来的不确定度各个分量详细情况见表2。根据表2中各个不确定度的分量可以计算出本次标准系列配制过程中各个分量带来的相对标准不确定度为：

由4.2.1.2和表2可以看出， 在20 ℃±4 ℃的温度波动下，量具使用过程中温度波动贡献的不确定度影响可以忽略不计。

表2 标准曲线定容及配制过程带来的不确定度

4.2.2.4 拟合标准曲线

标准曲线配好之后，调试好仪器设备后采用高效液相色谱仪进行测量，每个标准曲线浓度点重复测量3次，以所测标准溶液的质量浓度为横坐标，以测定的平均峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，并取得相应的回归方程，结果见表3。

表3拟合的线性回归方程

标准曲线测试完后，在同样的条件下进行样品测试，采用标准曲线法计算相应的检测结果，最终经过测定本次待测样品中糖精钠的浓度为5.811 mg/L，则由于标准曲线拟合所得的标准不确定度为：

将4.2.2.1至4.2.2.4中标物配制及拟合过程中的各分量合成标准物质带来的相对标准不确定度为:

4.3 合成不确定度

将上述实验过程中考虑到的并列入计算的各不确定度分量进行合成，得出本次测试的样品中糖精钠含量的相对标准不确定度为：

4.4 扩展不确定度

根据相关的不确定度评定要求，当置信概率P=95%时，取k=2，则本次实验运用该方法所得的相对扩展不确定度为：U95rel=k×Urel(p)=2×0.118=0.236。当样品中糖精钠含量为0.145 g/kg时，则扩展不确定度为0.145×0.236=0.034g/kg，则最终分析结果可表述为（0.145+0.034）g/kg，k=2。

5 结论

采用食品安全国家标准GB 5009.28—2016中高效液相色谱法测定酱腌菜中糖精钠的含量，最终本次分析结果表述为（0.145+0.034）g/kg，k=2。根据全部的检验检测过程对测量重复性、样品制备过程和标准曲线制备及拟合等进行了确定。通过对各个不确定度分量的定量分析，得出以下结论：该方法中标准曲线的拟合过程中的不确定度对整个实验过程中的不确定度贡献最大，样品称量、定容及重复性等带来的不确定度影响相对比较小，在温度波动为20 ℃±4 ℃下，量具使用过程中温度波动贡献的不确定度影响可以忽略不计。