基于DARTS 技术的丹参素钠直接结合靶蛋白鉴定*

陈缘静，蒋薇薇，李丽华，张成中，张 川，2，贾 丹**

1 海军军医大学 药学系，上海 200433；2 上海大学 医学院，上海 200444

丹参素是唇形科植物丹参（Salvia miltiorrhiza Bge.）中主要的水溶性酚酸类化合物，广泛用于心血管疾病的预防和治疗。丹参素结构中含有邻二酚羟基，易被氧化、稳定性差；另外由于羧基的存在，水溶性强，很难透过细胞膜的脂质双分子层，口服给药时绝对生物利用度低；同时羧基能够与葡萄糖醛酸结合随尿液排出体外，故在体内的半衰期很短，极大地限制了丹参素的临床应用[1]。丹参素钠是丹参素的羧酸盐，两者生物活性相当，但前者性质更为稳定。

丹参素钠注射剂于2016 年由CFDA 批准为中药一类新药进入Ⅰ期临床试验（CXZL1000089），用于冠心病及稳定性心绞痛的治疗。研究表明，丹参素钠可通过减轻自由基损伤、抑制炎症反应、防止心肌缺血损伤、促进血管内皮生长等多种途径发挥心脏保护作用[2]。但是，目前丹参素钠直接结合的靶蛋白仍不明确，其潜在心血管保护作用机制仍待深入研究。

明确药物作用靶点，有助于针对靶点进行药物结构的优化改造，以增强药效及降低药物的毒副作用。药物亲和反应靶点稳定技术（drug affinity responsive target stability，DARTS）是一种新型靶标鉴定方法，它的原理是药物与靶蛋白结合后能够稳定靶蛋白，使其抵抗蛋白酶的消化作用。该技术最大优势在于活性化合物无需任何结构修饰、不影响药物活性，适用于任何小分子化合物的靶蛋白鉴定[3]。目前，该技术已成功用于多种药物的靶点鉴定。因此，本研究拟采用DARTS 技术鉴定丹参素钠可能的直接结合靶蛋白，探究其心血管保护作用机制，为临床应用提供科学依据。

1 材 料

1.1 细胞

人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVEC）由海军军医大学药学系药理学教研室赠与。

1.2 药品与试剂

丹参素钠盐由海军军医大学药学系中药鉴定学教研室提供（纯度≥99%），用磷酸盐缓冲液（PBS）配成50 mmol·L-1母液于-20 ℃保存备用，使用时用细胞培养液稀释至不同浓度。胎牛血清（FBS）购自Gibco Life Technology Co.（澳大利亚）；Dulbecco 改良的Eagle 培养基（DMEM）和PBS 购自Hyclone（Thermo Fisher）；青霉素、链霉素和胰蛋白酶购自Gibco-BRL Co.（Rockville，MD，USA）；哺乳动物蛋白提取试剂盒M-PER®（Thermo Scientific）；链霉素蛋白酶（Pronase）（Roche，美国）；蛋白酶抑制剂（Complete Mini，Roche，美国）；，磷酸酶抑制剂、5×SDS-PAGE 蛋白上样缓冲液、快速银染试剂盒（碧云天生化公司）；CD44 抗体（BioVision）；GAPDH抗体、重组人CD44 蛋白（Abcam）；IRDye 800CW 山羊抗兔或IRDye 680RD 山羊抗鼠二抗（Rockland Immunochemicals，Inc.，美国）。

2 方 法

2.1 细胞培养

HUVEC 细胞用含10% FBS、100 U·mL-1青霉素和100 μg·mL-1链霉素的DMEM 培养基培养，置于37 ℃、5%CO2的培养箱中，取对数生长期的细胞进行后续实验。

蛋白提取按照M-PER®试剂盒说明书进行操作。取约1×107个贴壁生长的HUVEC 细胞，弃去完全培养基，以预冷PBS 液洗涤3 次，加入含蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的提取缓冲溶液1 mL，冰上孵育10 min，涡旋5 min，4 ℃14000×g 离心15 min，收集上清液即为蛋白溶液。BCA 法测定蛋白浓度，立即进行后续实验。

2.2 链霉素蛋白酶Pronase 浓度的考察

取含有100 μg 蛋白的20 μL 反应体系，共7份，分别加入2 μL 不同终浓度的Pronase（0、0.01%、0.03%、0.1%、0.3%、1%和3%，浓度以蛋白酶质量相对于总蛋白质量的百分数表示），混匀后室温孵育30min，分别加入5×SDS-PAGE 蛋白上样缓冲液6μL，煮沸10 min，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE），对凝胶进行硝酸银染色，采用GS-800 光密度扫描仪（Bio-Rad，美国）采集图像。

2.3 丹参素钠浓度的考察

取含有100 μg 蛋白的20 μL 反应体系，共6 份，分别加入不同终浓度（0、10、50、250、500、1000 μmol·L-1）的丹参素钠2 μL，混匀后室温孵育60 min，分别加入终浓度为0.03%的Pronase 2 μL，混匀后室温孵育30 min，分别加入5×SDS-PAGE 蛋白上样缓冲液6 μL，煮沸10 min，后续步骤同上。

2.4 链霉素蛋白酶、丹参素钠浓度的考察

取含有100 μg 蛋白的20 μL 反应体系，共7份，分别加入终浓度500 μmol·L-1的丹参素钠2 μL，混匀后室温孵育60 min，分别加入不同终浓度的Pronase（0、0.01%、0.03%、0.1%、0.3%、1%和3%，浓度以蛋白酶质量相对于总蛋白质量的百分数表示）2 μL，混匀后室温孵育30 min，分别加入5×SDSPAGE 蛋白上样缓冲液6 μL，煮沸10 min，后续步骤同上。

2.5 DARTS 实验鉴定丹参素钠拟结合靶标蛋白

参照文献报道[4，5]，取含有100 μg 蛋白的20 μL反应体系，共7 份，分别加入不同终浓度的丹参素钠（0、10、50、250、500、1000 μmol·L-1）2 μL，混匀后室温孵育60 min，分别加入终浓度0 或0.03%的Pronase（浓度以蛋白酶质量相对于总蛋白质量的百分数表示）2 μL，混匀后室温孵育30 min，分别加入5×SDS-PAGE 蛋白上样缓冲液6 μL，煮沸10 min，进行SDS-PAGE 电泳，银染，取目标条带交由生工生物工程（上海）股份有限公司通过基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱（MALDI-TOF）及特异性肽段进行蛋白质解析，并通过Western blotting 验证。

2.6 免疫印迹实验（Western blotting）

取30 μg 蛋白样品进行SDS-PAGE 电泳，转移至PVDF 膜（0.45 μm），5%脱脂牛奶室温封闭2 h。然后将膜与CD44（1∶2000）和GAPDH（1∶3000）一抗4 ℃孵育过夜，最后与IRDye 800CW 山羊抗兔或IRDye 680RD 山羊抗鼠二抗(1∶5000)室温避光孵育2 h。GAPDH 作为内参。LI-COR 检测系统和Tanon图像系统（Tanon，China）分析蛋白条带灰度。

2.7 表面等离子共振分析丹参素钠与潜在靶标蛋白的结合

将50 μg·mL-1纯化的人全长CD44 蛋白（Abcam）应用氨基偶联法固定到HisCap 传感器芯片表面。在流动相缓冲液（1×PBS，0.5% DMSO）中加入不同浓度的丹参素钠，观测芯片产生的响应信号。使用Biacore T2000（GE Healthcare）控制软件计算结合和解离速率常数。结合亲和力用结合速率常数与解离速率常数的比率表示。

3 结果

3.1 DARTS 实验

在DARTS 实验中，蛋白酶的作用浓度是考虑的首要因素。不同终浓度的蛋白酶Pronase（0、0.01%、0.03%、0.1%、0.3%、1%和3%）对HUVEC 细胞总蛋白的消化作用如图1A 所示。与不加Pronase的对照组相比，较低浓度的Pronase（0.01%）对蛋白的消化作用较弱，蛋白条带与对照组几乎没有差别；而较高浓度的Pronase（0.1%、0.3%、1%和3%）对蛋白的消化作用过强，分子量较大的蛋白几乎完全被消化成分子量较小的蛋白或肽段。因此，选取消化作用适中的0.03% Pronase 作为本次DARTS 实验中的酶浓度。

药物与靶蛋白的结合存在浓度依赖关系，因此药物浓度是DARTS 实验中的另一个重要因素。对于亲和力较低或亲和力未知的化合物，文献推荐使用浓度为500 μmol·L-1的化合物，在此浓度下不会因为化合物的浓度过高产生非特异性结合[6]。比较不同浓度丹参素钠作用下Pronase 对HUVEC 细胞总蛋白的消化作用，结果如图1B 所示。在较高浓度（1000 μmol·L-1）的丹参素钠作用时，给药组与对照组的蛋白条带能够呈现出差异，在低分子量处对照组较重。而在较低浓度（10、50 μmol·L-1）的丹参素钠作用时，给药组与对照组的差异不明显。因此，为了能够鉴定出更为明显的丹参素钠的结合蛋白，选取500 μmol·L-1丹参素钠作为本实验中的药物浓度。

在500 μmol·L-1丹参素钠浓度下，加入不同浓度的Pronase 作用。如图1C 所示，500 μmol·L-1丹参素钠、0.03% Pronase 作用时，给药组与对照组的差异蛋白条带较为明显。接下来，将HUVEC 细胞蛋白裂解液与不同浓度的丹参素钠孵育，然后用0.03%Pronase 消化。采用SDS-PAGE 的方法来表征DARTS 实验的结果，从凝胶上鉴别出给药组和对照组中的差异蛋白条带。银染结果表明，与丹参素钠孵育的细胞蛋白裂解物约在100 kDa 处有明显的条带，且随着丹参素钠浓度的增加愈加清晰（图1D）。根据DARTS 技术原理，丹参素钠能够保护此条带中的蛋白使其抵抗pronase 链霉蛋白酶的消化作用，故认为此条带中的蛋白是可能的丹参素钠在HUVEC 细胞中的结合靶蛋白。

图1 DARTS 实验中链霉素蛋白酶Pronase、丹参素钠作用浓度的考察

3.2 蛋白质谱分析及Western blotting 验证丹参素钠结合蛋白

采用基质辅助激光解吸电离飞行时间串联质谱（MALDI-TOF/TOF MS），分析对照组与丹参素钠给药组的SDS-PAGE 差异蛋白切割胶。结合两次蛋白质谱分析结果，通过Mascot 检索，利用特异性肽段，结合蛋白分子量、肽段可信度的综合评分，初步筛出CD44 可能为丹参素钠的结合靶蛋白，有4 条特异性肽段被鉴定到（见图2A）。将经过DARTS 实验的样品，采用蛋白质印迹（Western blotting）通过CD44 鼠抗人单克隆抗体进一步证实。结果如图2B 所示，不同浓度的丹参素钠与目的蛋白CD44 结合后，均不同程度地提高了目的蛋白CD44 的稳定性，降低了Pronase 对CD44 的消化作用。

图2 （A）靶蛋白的质谱鉴定结果（B）Western blotting 验证丹参素钠与结合靶标蛋白CD44 的DARTS 实验结果

3.3 利用表面等离子体共振（SPR）技术测定丹参素钠与靶蛋白之间的结合常数

DARTS 及蛋白质免疫印迹实验表明，丹参素钠在HUVEC 细胞中可能的结合靶蛋白为CD44，然后用BiacoreT200 生物分子相互作用分析系统、进行丹参素钠与靶蛋白CD44 相互作用的动力学分析。成功测定了丹参素钠1000、500、250、125、62.5、31.25、15.625 μmol·L-1等浓度下的响应值，计算出丹参素钠与靶蛋白CD44 的结合常数为4.84×10-4mol·L-1，见图3。

图3 CD44 对不同浓度的丹参素钠的响应曲线

4 讨论

前期课题组利用HuProtTM20K 人类蛋白组芯片，发现丹参素钠可与370 个蛋白产生特异性结合[7]。尽管该方法是一种鉴定蛋白质-小分子相互作用快速经济、高通量的手段；但其自身也存在一些局限性[8]：蛋白质组芯片是在体外分子水平研究蛋白质与化合物的相互作用的，芯片中的蛋白质固定之后失去了它们的天然结构；高丰度蛋白会干扰低丰度蛋白的检测，导致假阳性结果；非特异性结合存在干扰效应；该技术是基于“勾钓”原理，无法鉴别与化合物产生瞬时作用的靶蛋白。

本实验以DARTS 技术鉴定丹参素钠在人脐静脉内皮细胞中的结合靶蛋白。该方法最大的优势是小分子化合物无需任何结构修饰，不影响化合物的生物活性。鉴于DARTS 实验对于蛋白酶作用浓度及药物浓度都有严格的要求，本实验通过酶浓度和化合物浓度梯度实验，确定了以0.03%的蛋白酶浓度和500 mmol·L-1的化合物浓度作为实验的最终条件。

结果表明，丹参素钠在HUVEC 细胞中可能的结合靶蛋白为CD44。CD44 是一种细胞表面跨膜糖蛋白，参与细胞的增殖、分化、迁移以及血管生成等多项生命活动[9]。研究表明，CD44 与心血管疾病密切相关。Yang LW 等[10]发现，小鼠CD44 缺乏可保护心脏抵抗血管紧张素Ⅱ诱导的心脏纤维化；Suleiman M等[11]报道，CD44-透明质酸相互作用参与细胞外基质重塑、组织纤维化和心力衰竭等过程。另外，大量研究发现，CD44 在许多癌细胞中都有异常表达，与癌症的侵袭和转移有着密切的联系[12]。丹参素钠可为CD44 小分子抗肿瘤抑制剂的设计提供新型骨架。

本实验利用表面等离子体共振技术（surface plasmon resonance，SPR）测定丹参素钠与靶蛋白之间的结合常数为4.84×10-4mol·L-1，药物与靶蛋白的结合能力较弱，有可能是该技术本身的局限性。SPR生物传感器灵敏度较低，尤其当生物识别原件为分子量较大的膜蛋白（如CD44）、而被检测的药物分子量较小时，响应信号就会比较弱[13]。所以测得分子量小的丹参素钠与靶蛋白膜蛋白CD44 之间的结合常数较小，并不代表丹参素钠的靶蛋白不是CD44。丹参素钠在人脐静脉内皮细胞中的直接结合靶蛋白为CD44，可能通过与CD44 蛋白结合并发挥心血管保护作用。后续需要在分子、细胞及整体动物水平上围绕丹参素钠对CD44 的生物学效应开展深入研究。