高效液相色谱法测定枇杷润喉糖中11 个成分的含量

尚 姝，方 方，刘 园

江苏省食品药品监督检验研究院，南京 210019

枇杷润喉糖是常见的清咽类保健食品之一，在清咽润喉方面有着独特的优势。枇杷叶为2014 年新批准的食品原料，具有清肺止咳、降逆止呕作用。枇杷叶的化学成分有三萜酸、黄酮类、多酚、倍半萜及糖苷类等[1-3]，其中黄酮类成分具有良好的抗氧化、降血脂、抑菌杀菌、增强免疫等作用[4，5]；三萜酸类成分具有抗炎止咳、降血糖、抗病毒和抗氧化的作用[6，7]。枇杷叶中三萜类成分主要有齐墩果酸、熊果酸、蔷薇酸、委陵菜酸、马斯里酸、科罗索酸等；黄酮类成分有山柰酚、槲皮素、高良姜素、橙皮苷、金丝桃苷、槲皮苷、异槲皮苷、芦丁等[8-10]。目前在含有枇杷的清咽润喉类保健食品的质量标准中，多采用紫外分光光度法，以芦丁为对照品测定样品中总黄酮的含量，该方法专属性不强。本试验选择枇杷叶中3 个主要三萜成分、8 个主要黄酮类成分等11 个成分作为质量控制指标，采用高效液相色谱法进行检测，为清咽类保健食品枇杷润喉糖的质量控制提供参考方法。

1 仪器与药品、试剂

高效液相色谱仪（日本Shimadzu 公司）；分析天平（德国Sartorius 公司）；超声清洗仪（德国Wiggens公司）。

对照品：芦丁（批号：100080-202012）、金丝桃苷（批号：111521-201809）、异槲皮苷（批号：111809-201804）、槲皮苷（批号：111538-202007）、橙皮苷（批号：110721-202019）、槲皮素（批号：100081-201610）、山奈酚（批号：110861-201310）、高良姜素（3，5，7-三羟基黄酮，批号：111699-201703）、科罗索酸（批号：S27D9H78340）、齐墩果酸（批号：110709-201808）、熊果酸（批号：110742-201823），均购自中国食品药品检定研究院；甲醇、乙腈、磷酸均为色谱纯；水为超纯水。

样品分别为A、B、C、D、E 厂家，来自2021 年国家保健食品风险监测部门的检品。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液的配制

取除橙皮苷外其他10 个对照品5 mg，精密称定，置5 mL 量瓶中，用甲醇定容至刻度，混匀，得10个对照品的单标储备液。

取橙皮苷对照品10 mg，精密称定，置15 mL 量瓶中，用甲醇定容至刻度，得橙皮苷单标储备液。

精取以上11 个对照品单标储备液适量，置10mL量瓶中，用甲醇定容至刻度，混匀，得一定浓度的混标储备液S5。

精取混标储备液S5 0.5、1.0、2.0、4.0mL，置10mL量瓶中，用甲醇定容至刻度，混匀，得系列对照品溶液S1～S4。

2.2 样品溶液的配制

取供试品适量，研细，混匀，取约1 g（精确至0.001 g），精密称定，置具塞试管中，加入甲醇25 mL，密塞，涡旋1 min，超声提取30 min，冷却至室温，摇匀，过0.45 μm 微孔滤膜，备用。

2.3 色谱条件与系统适用性要求

色谱柱为Kromasil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相A：0.1%磷酸水，流动相B：乙腈，按表1 梯度洗脱；检测波长：210 nm；柱温为35 ℃；流速：1.0 mL·min-1；进样量：10 μL；。

表1 流动相梯度

取“2.1”项下混合对照品溶液适量，按上述色谱条件进行检测，记录色谱图（见图1）。各色谱峰的理论板数均大于7000。

2.4 流动相优化

考察了0.1%甲酸溶液-甲醇、0.1%磷酸-甲醇、0.1%甲酸-乙腈、0.1%磷酸-乙腈等4 个流动相系统，结果选用0.1%磷酸-乙腈作为流动相溶液，在表1 梯度洗脱下获得良好的分离效果，所测11 个成分均得到有效分离，有关色谱图见图1。

图1 11 个成分对照品色谱图及样品色谱图

2.5 线性范围、检测限与定量限

取系列对照品溶液，注入液相色谱仪，按“2.3”项下色谱条件测定，记录峰面积。以峰面积Y 为纵坐标，对照品溶液浓度X（μg·mL-1）为横坐标，绘制标准曲线，各成分的线性范围见表2。将对照品溶液注入高效液相色谱仪，按“2.3”色谱条件进样检测，以信噪比约为3∶1 的量确定为检测限；约为10∶1 的量确定为定量限，得到11 个成分的检测限和定量限。见表2。

表2 线性、线性范围、检测限及定量限

2.6 进样精密度试验

取对照品溶液S5 适量，按“2.3”项下色谱条件连续进样6 次，分别记录11 个成分的峰面积，芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮苷、橙皮苷、槲皮素、山奈酚、高良姜素、科罗索酸、齐墩果酸、熊果酸的RSD（n=6）分别为0.38%、0.31%、0.28%、0.20%、0.36%、0.32%、0.19%、0.20%、0.19%、0.13%、0.13%，表明仪器精密度良好。

2.7 稳定性试验

取对照品溶液S5，按“2.3”项下色谱条件分别在0、3、6、9、12、15、18、21、24 h 进样检测，记录峰面积，结果芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮苷、橙皮苷、槲皮素、山奈酚、高良姜素、科罗索酸、齐墩果酸、熊果酸RSD（n=6）分别为1.88%、1.19%、1.26%、0.52%、1.48%、0.60%、0.44%、0.45%、0.42%、0.53%、0.41%，表明稳定性良好。

2.8 重复性试验

取A 厂家供试品适量，按“2.2”项下方法，平行制备6 份供试品溶液，按“2.3”项下色谱条件进样检测，计算金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮苷、槲皮素、山奈酚、科罗索酸、齐墩果酸、熊果酸等8 个成分的峰面积，RSD 分别为0.63%、2.62%、0.99%、1.76%、0.66%、0.94%、1.15%、0.60%，表明方法重复性良好。

2.9 回收率试验

取A 厂家供试品0.5 g，加入适量对照品溶液，按“2.2”项下操作，平行制备6 份，按“2.3”项下色谱条件进样检测，用标准曲线法计算各成分的测得量，计算加样回收率，结果见表3，表明方法准确度良好。

表3 各组分加样回收率测定结果（n=6）

2.10 样品含量测定

取5 个厂家的样品，分别按“2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.3”项下色谱条件进样检测，结果见表4。

表4 5 个厂家的样品测定结果（mg/100 g）

测定结果显示，厂家E 所有成分均未检出；厂家D 仅检出科罗索酸一个成分；其余A、B、C 3 厂家样品检出成分在4～8 个。在5 个厂家的样品中，只有厂家C 检出现行质量标准中作为指标成分总黄酮的芦丁。

3 小 结

本研究建立了枇杷润喉糖中11 个主要成分的含量测定方法，经方法学验证基本可行。利用所建立的方法对2021 年国家保健食品风险监测部门收集到的5 个厂家样品进行了检测，结果不同厂家之间产品质量差异大，提示有可能存在投料所用提取物的加工工艺不同所致，或另有其他原因。枇杷润喉糖现有的检测方法专属性不强；本方法能够快速检测枇杷润喉糖中的多种组分，专属性较强，为评价该类产品的质量提供了参考方法。