葡萄糖和L-丙氨酸对藻菌共生系统处理养殖废水的影响研究*

韦嘉璐 艾思洁 张 芯 王 磊 吴国芳 王海英#

(1.中南民族大学生命科学学院，湖北 武汉 430074；2.青海大学畜牧兽医科学院，青海 西宁 810016)

微藻是一类光合自养生物，具有生长周期短、环境适应性强的特性[1]，可以去除养殖废水中的氮、磷及金属离子等[2]，但纯藻系统在处理养殖废水时存在明显缺陷，如稳定性差、易被外来物种污染、对设备要求高、对污水中COD去除效果不佳等[3]。近年来，建立藻菌共生系统进行废水处理的研究引起了广泛关注。DE BASHAN等[4]采用巴西固氮螺菌与小球藻组成藻菌共生系统，其对城市污水中的氨氮、硝酸盐氮和磷的去除效率分别达到100%、15%和36%，显著高于纯藻系统。有研究发现小球藻和大肠杆菌共生系统中，大肠杆菌促进了小球藻的生物量增长，在处理模拟城市废水时大大缩短了消耗营养物质的时间[5]。AMIN等[6]、张晶等[7]认为植物促生菌可以分解有机物、固定无机氮和提供CO2促进微藻的生长，而微藻又可提供O2促进菌的生长。

芽孢杆菌可以在养殖废水中生长，并降解水体中氨氮和残饵等[8]。JI等[9]发现小球藻和地衣芽孢杆菌共生系统对合成污水处理效果较好，COD、总溶解磷(TDP)和总溶解氮(TDN)的去除率分别为86.55%、80.28%和88.95%，而铜绿微囊藻和地衣芽孢杆菌共生系统处理效果明显劣于小球藻和地衣芽孢杆菌共生系统。本实验室在前期工作中构建多组藻菌共生系统，许多藻菌共生系统较纯藻系统在净化养殖废水中并未表现出明显优势[10]，说明藻种和菌种的筛选是构建藻菌共生系统的关键因素。后续实验中发现，补充少量葡萄糖与微量L-丙氨酸可提升藻菌共生系统对养殖废水的处理效率[11]，说明藻菌共生系统对废水的处理效果与废水营养特性相关。

本研究以前期筛选的对养殖废水污染物具有较好去除效率的莱茵衣藻(ChlamydomonasreinhardtiiCC-125)与凝结芽孢杆菌(BacilluscoagulansBS32)共生系统为研究对象，考察藻菌共生系统处理养殖废水的过程中，微藻和细菌的生长以及污染物去除的变化，进一步筛选了共代谢碳源，考察少量葡萄糖和微量L-丙氨酸对莱茵衣藻-凝结芽孢杆菌共生系统处理养殖废水的促进机制，为高效的藻菌共生系统在养殖废水处理的规模化应用提供理论和技术支撑。

1 材料与方法

1.1 莱茵衣藻和凝结芽孢杆菌

莱茵衣藻获自中国科学院水生生物研究所淡水藻种库，于三醋酸磷酸酯(TAP)培养基中培养，培养条件为恒温25 ℃，光暗周期12 h∶12 h，光照强度40 μmol/(m2·s)。

凝结芽孢杆菌获自中南民族大学食品与生物工程研究所，接种于牛肉膏蛋白胨培养基中，培养条件为恒温37 ℃，转速200 r/min摇床培养。

1.2 废水水质特征

实验所用废水为猪场养殖废水，从武汉市郊区某养猪场获得。使用壳聚糖为絮凝剂，海藻酸钠为补充剂对猪场养殖废水原液进行絮凝处理，沉淀3 h后取上清液用去离子水稀释10倍，121 ℃高压灭菌20 min后进行后续实验。此时，养殖废水中氨氮、TN、TP、COD分别为(20.0±0.5)、(80.0±1.3)、(22.0±1.3)、(1 000.0±18.6) mg/L。

1.3 藻菌共生系统构建

取对数生长期的莱茵衣藻和凝结芽孢杆菌，5 000 r/min离心5 min，去离子水洗涤3次，使用预处理后的养殖废水重悬，制得初始细胞密度分别为7.6×108、1.0×108cfu/mL的莱茵衣藻和凝结芽孢杆菌悬液，将重悬的莱茵衣藻和凝结芽孢杆菌分别以10%(体积分数，下同)和1%的接种量接种到养殖废水中，构建纯藻系统与纯菌系统，将10%莱茵衣藻和1%凝结芽孢杆菌同时接种到养殖废水中，构建藻菌共生系统。将各培养系统放置于光照培养箱中，25 ℃下连续培养，光照强度40 μmol/(m2·s)，光暗周期12 h∶12 h。培养过程中定时采集培养液样品，5 000 r/min离心10 min，取上清液测定COD、氨氮、TN、TP。为考察添加营养物质后藻菌共生系统对养殖废水净化效能及藻菌生长的影响，分别向藻菌共生系统添加0.5 g/L葡萄糖以及0.5 g/L葡萄糖和100 μmol/L L-丙氨酸,相同条件下培养，定期采集培养液样品测定水质指标及藻菌生长变化。

1.4 分析方法

1.4.1 水质指标的测定

COD采用COD试剂盒法测定；TN使用《水质 总氮的测定 碱性过硫酸钾消解紫外分光光度法》(HJ 636—2012)测定；氨氮使用《水中氨态氮的标准试验方法》(ASTMD 1426-15)测定；TP使用《水质 总磷的测定 钼酸铵分光光度法》(GB 11893—89)测定。

1.4.2 碳源利用的测定

Biolog EcoPlateTM微孔板可以通过微生物对碳源利用时所反映的颜色变化来检测碳利用率，微孔板包含31种碳源，每种碳源有3个重复样本。将Biolog EcoPlateTM微孔板预热至25 ℃，分别取莱茵衣藻、凝结芽孢杆菌和藻菌共培养物，用微量移液器取125 μL移至微孔板中，加样完毕盖上板盖，恒温25 ℃下光照静置培养，连续培养120 h，每隔24 h用酶标仪读取590 nm处吸光度，记录数据。

1.4.3 莱茵衣藻和凝结芽孢杆菌的生长测定

以每10倍为一个梯度将培养液稀释104～106倍，涂布到牛肉膏蛋白胨固体培养基上，37 ℃下孵育48 h，用平板计数法计算凝结芽孢杆菌的菌落数目。

取1 mL培养液与5 mL 90%(体积分数)丙酮溶液混合，4 ℃暗处理24 h。6 000 r/min下离心5 min，取上清液分别在630、647、664、750 nm处测量吸光度，根据式(1)计算叶绿素总质量浓度[12]：

Fx=[4.75(OD664-OD750)+11.89(OD647-OD750)+20.98(OD630-OD750)]VE/VS

(1)

式中：Fx为莱茵衣藻叶绿素总质量浓度，mg/L；OD664、OD750、OD647、OD630分别为上清液在664、750、647、630 nm处的吸光度；VE为混合溶液的体积，mL；VS为测量样品的体积，mL。

1.4.4 葡萄糖含量测定

用3,5-二硝基水杨酸(DNS)通过比色法对样品中的葡萄糖进行定量测定，具体操作方法参考文献[13]。

1.4.5 叶绿素荧光强度测定

使用FMS-2便携脉冲调制式荧光仪测量叶绿素荧光。取2 mL培养液在20 ℃室温下暗适应15 min，通过测量光束确定叶绿素的固定荧光产量，并用饱和光脉冲测量最大荧光产量，根据式(2)计算叶绿素荧光参数：

Fv/Fm=(Fm-F0)/Fm

(2)

式中：Fv为可变荧光产量；Fm为最大荧光产量；F0为固定荧光产量；Fv/Fm为光系统Ⅱ(PSⅡ)的最大光化学量子产量，反映PSⅡ的最大光能转化效率。

2 结果与讨论

2.1 各培养系统对养殖废水的处理效果

纯藻系统、纯菌系统以及藻菌共生系统对养殖废水的处理效果见图1。

由图1(a)可见，在连续5 d的培养过程中，藻菌共生系统对养殖废水COD的去除率均高于纯藻和纯菌系统，培养初期纯藻系统与藻菌共生系统对养殖废水COD的去除效果接近，培养第2天纯藻系统对养殖废水COD去除率达到最大值63.26%，随后开始逐渐降低。藻菌共生系统在培养第3天对养殖废水COD去除率达到最高值65.28%，之后略微下降并总体趋于稳定。纯菌培养系统对COD去除率基本保持上升趋势，在培养第5天COD去除率与纯藻系统接近。

由图1(b)可见，纯藻系统和藻菌共生系统对养殖废水氨氮去除效果良好，且去除趋势相似。纯藻系统和藻菌共生系统在培养第5天对氨氮去除率均在60%以上，而纯菌系统氨氮去除率仅在30%左右，远低于纯藻系统和藻菌共生系统。

由图1(c)可见，纯藻系统和藻菌共生系统在培养前4天TN去除率变化趋势一致，培养第4天时TN的去除率分别为62.52%、64.88%。培养第5天纯藻系统对TN的去除效率仍在上升，而藻菌共生系统对TN的去除有所下降。在纯菌系统中，培养前4天养殖废水TN去除率总体处于平稳状态，第5天TN去除率大幅增加。

由图1(d)可见，纯菌系统培养初期TP浓度有所上升，TP去除率呈现负值，这可能是因为芽孢杆菌去除TP需要周期性循环，芽孢杆菌中积聚的磷存在释放[14]，第3天后TP去除率逐渐上升。而纯藻系统和藻菌共生系统对TP的去除效果接近，培养第5天时两系统TP去除效率基本一致。

综上可知，相较于纯藻系统，藻菌共生系统对养殖废水的净化效果并未表现出明显优势，可能是养殖废水的营养限制不利于藻菌共生系统中莱茵衣藻和凝结芽孢杆菌的生长。

2.2 碳源的选择

以Biolog EcoPlateTM微孔板检测藻菌的碳源利用情况，以期通过共代谢促进养殖废水中有机物的降解。根据化学基团的性质，将Biolog EcoPlateTM微孔板上的31种碳源分为6个类别：酯类、羧酸、氨基酸、碳水化合物、胺类、醇类[15]。莱茵衣藻、凝结芽孢杆菌以及莱茵衣藻和凝结芽孢杆菌的藻菌混合对碳源的利用情况见图2。

图2 碳源的利用情况

由图2可见，藻菌混合对6种碳源的利用情况由强到弱依次为酯类、碳水化合物、胺类、氨基酸、羧酸、醇类。相较单独的莱茵衣藻而言，藻菌混合在保持对酯类高利用率的同时，大幅度提升了对碳水化合物的利用程度；而与单独的凝结芽孢杆菌相比，藻菌混合后保持了对碳水化合物的高利用率，同时酯类利用率也得到了提高。总体看来，酯类和碳水化合物具备作为藻菌共代谢体系营养物的潜力。

在对31种碳源利用能力的分析中，藻菌混合对丙酮酸甲酯、D-纤维二糖、β-甲基-D-葡萄糖苷和N-乙酰基-D-葡萄糖胺的利用效率最高，其中两种碳源为葡萄糖衍生物，说明莱茵衣藻-芽孢杆菌的藻菌共生系统可能对葡萄糖衍生物类碳源具有偏好性。SHI等[16]研究表明，通过添加葡萄糖、乳糖等生长基质可以加快微生物对难降解物质的降解速率，实验结果为藻菌共生系统处理养殖废水的共代谢碳源的选择提供了方向。

2.3 葡萄糖和L-丙氨酸对藻菌共生系统的影响

葡萄糖和L-丙氨酸对藻菌共生系统处理养殖废水的影响见图3。

从图3可以看出，添加0.5 g/L葡萄糖和100 μmol/L L-丙氨酸可以显著提高藻菌共生系统对养殖废水的处理效果，连续培养5 d后养殖废水中COD、氨氮、TN、TP去除率分别从63.21%、60.68%、58.58%、80.49%提高到72.47%、91.07%、96.65%和89.29%。

图3 葡萄糖和L-丙氨酸对藻菌共生系统处理养殖废水的影响

与无添加的藻菌共生系统相比，葡萄糖共代谢作用提升了藻菌共生系统对养殖废水的处理效果。添加葡萄糖的藻菌共生系统COD去除率在培养第3天达到最高值(77.26%)，比无添加的藻菌共生系统提高11.98百分点；氨氮去除率也在培养第3天达到最大值68.65%，而无添加的藻菌共生系统氨氮去除率最大只有60.68%；无添加藻菌共生系统对TN的最大去除率仅为58.58%，而添加葡萄糖后TN最大去除率提高到67.16%；添加葡萄糖的藻菌共生系统在培养第1天TP去除率就快速升高并趋于平稳，在第4天高达95.91%，而无添加的藻菌共生系统TP的去除率最高为80.49%。进一步对同时添加葡萄糖和L-丙氨酸的藻菌共生系统进行分析，该培养系统对COD、TP的最大去除率分别为72.47%、89.29%，比仅添加葡萄糖的藻菌共生系统分别低4.79百分点、6.62百分点；但该系统对TN和氨氮去除效果提升明显，TN和氨氮的最大去除率分别为96.65%、91.07%，与添加葡萄糖的藻菌共生系统相比，分别提高了29.49百分点、22.42百分点。可见，L-丙氨酸的添加未能提高菌藻共生系统对TP和COD的去除效果，但TN和氨氮的去除率明显上升。凝结芽孢杆菌具备降解养殖水体中氨氮的潜能，说明L-丙氨酸可能对藻菌共生系统中微藻生长无明显作用，但对凝结芽孢杆菌产生了促进作用。

2.4 葡萄糖和L-丙氨酸对莱茵衣藻的影响

葡萄糖和L-丙氨酸对藻菌共生系统中莱茵衣藻的影响见图4。

微藻生物量可以通过叶绿素含量的变化反映[17]。由图4可见，藻菌共生系统中添加葡萄糖后，莱茵衣藻叶绿素含量明显增加，即微藻生物量增加，葡萄糖作为辅助碳源促进了微藻生物量的积累，从而提高系统对营养物质的去除能力。L-丙氨酸等游离氨基酸也可以被微藻直接利用[18]，但同时添加葡萄糖和L-丙氨酸后莱茵衣藻的生物量要低于仅添加葡萄糖的藻菌共生系统。

图4 葡萄糖和L-丙氨酸对藻菌共生系统中莱茵衣藻生长的影响

叶绿素荧光可在不破坏活体微藻的情况下反映其光合活性，呈现光合作用中微藻光合生理状况与环境胁迫关系[19-20]。根据测试结果，莱茵衣藻细胞叶绿素荧光参数Fv/Fm初始值为0.83，处理养殖废水后Fv/Fm逐渐下降，但培养第5天时Fv/Fm仍稳定在0.6～0.8，添加葡萄糖以及添加葡萄糖和L-丙氨酸对莱茵衣藻光合活性无明显影响，培养第5天时Fv/Fm分别为0.65、0.71，说明添加葡萄糖和L-丙氨酸后微藻仍可以保持良好的光合生理状态，微藻自身光合活性并未受到影响。

2.5 葡萄糖和L-丙氨酸对凝结芽孢杆菌的影响

由图5(a)可见，相比于无添加的藻菌共生系统，添加葡萄糖的藻菌共生系统凝结芽孢杆菌的细胞数量在培养第1天显著增加，从1.21×105cfu/mL增加到2.97×105cfu/mL，而同时加入葡萄糖和L-丙氨酸的藻菌共生系统在培养第1天凝结芽孢杆菌细胞数量进一步提高到7.17×105cfu/mL，但在培养第2天，3个系统中凝结芽孢杆菌细胞数量均大幅下降。由图5(b)可见，藻菌共生系统对葡萄糖利用速率很快，单独或与L-丙氨酸同时添加葡萄糖后，藻菌共生系统中的葡萄糖在培养第2天分别降至0.092、0.116 g/L，此时藻菌共生系统中凝结芽孢杆菌几乎不能生长，说明养殖废水中的营养体系不利于凝结芽孢杆菌的生长，葡萄糖可以作为藻菌共生系统的辅助碳源但很快被消耗殆尽。在添加L-丙氨酸后，与仅添加葡萄糖的藻菌共生系统相比，莱茵衣藻生物量略微下降(见图4)，可能因为微量L-丙氨酸作为凝结芽孢杆菌萌发剂促进了凝结芽孢杆菌萌发，消耗了部分葡萄糖，从而与莱茵衣藻形成了营养竞争关系。

图5 葡萄糖和L-丙氨酸对藻菌共生系统中凝结芽孢杆菌生长的影响

葡萄糖能够充当营养物质促进凝结芽孢杆菌的生长，而L-丙氨酸作为凝结芽孢杆菌的萌发剂，可与共萌发物如糖、核苷和其他氨基酸等加速凝结芽孢杆菌的萌发[21]， YASUDA等[22]研究表明，葡萄糖可以通过协同作用增强L-丙氨酸结合亲和力，提升凝结芽孢杆菌萌发率。在本研究中，葡萄糖和L-丙氨酸添加显著提高了藻菌共生系统对养殖废水的处理效果，说明葡萄糖能促进藻菌的共代谢作用，微量L-丙氨酸极大程度地刺激了藻菌共生系统中凝结芽孢杆菌的生长，与上述文献研究结果一致，并且适量的葡萄糖和L-丙氨酸不会对藻菌共生系统处理养殖废水产生二次污染。

3 结 论

(1) 相较于莱茵衣藻的纯藻系统，莱茵衣藻-凝结芽孢杆菌的藻菌共生系统对养殖废水的净化效果并未表现出明显优势。酯类和碳水化合物具备作为藻菌共代谢体系营养物的潜力，莱茵衣藻-凝结芽孢杆菌的藻菌共生系统可能对葡萄糖衍生物类碳源具有偏好性。

(2) 向藻菌共生系统中添加0.5 g/L葡萄糖和100 μmol/L L-丙氨酸可以显著提高养殖废水净化效果，连续培养5 d后养殖废水COD、氨氮、TN和TP去除率可分别从63.21%、60.68%、58.58%、80.49%提高到72.47%、91.07%、96.65%和89.29%。

(3) 在莱茵衣藻-凝结芽孢杆菌共生系统中，添加葡萄糖和L-丙氨酸后微藻仍可以保持良好的光合生理状态，微藻自身光合活性并未受到影响。葡萄糖可以促进莱茵衣藻和凝结芽孢杆菌营养体生物量的增加，微量的L-丙氨酸可作为凝结芽孢杆菌的萌发剂，刺激凝结芽孢杆菌的萌发，加速藻菌共生系统对养殖废水中有机物的利用。