不同生物炭对猪粪堆肥过程中抗生素及抗生素抗性基因的削减规律研究*

包灿鑫 张 园 陈明龙 周 洁 何文程 史鑫成

(苏州科技大学环境科学与工程学院，江苏 苏州 215009)

抗生素被广泛应用于畜禽养殖业，未被完全吸收的抗生素和在动物肠道内携带抗生素抗性基因(ARGs)的菌株随着畜禽粪便排出体外[1]，动物养殖业造成的畜禽粪便污染成为环境中抗生素和ARGs的主要污染源之一。现有研究表明，好氧堆肥能有效降低猪粪中的抗生素浓度和ARGs丰度[2-3]，进而减轻畜禽粪便还田对环境中抗生素和ARGs的影响。生物炭是生物质在低温、缺氧条件下热解形成的一种多孔富碳产物，由于多孔、疏水性和低密度的特性常被用于农业领域来解决能源、环境、食品和气候等多方面的问题。

对于抗生素，SRINIVASAN等[4]研究发现，高温制备的松木屑生物炭比低温生物炭能更显著增加牧场土壤对磺胺甲恶唑(SMX)的吸附；韩璇[5]研究发现，水稻秸秆生物炭对底泥中SMX的吸附机制主要为沉淀作用和表面络合作用，吸附能力明显强于再力花生物炭；陈淼等[6]研究发现，甘蔗渣生物炭提高了土壤对氧氟沙星和诺氟沙星(NOR)的吸附量，非线性吸附过程主要受到表面吸附、分配作用和其他微弱作用力的共同影响。还有研究发现，生物炭的比表面积和芳香化结构影响着抗生素的分配系数[7]；PENG等[8]通过实验，发现了不同生物炭对抗生素的吸附源于抗生素上的π键与生物炭芳香环上的π键形成π-π电子供体-受体作用(π-π EDA)。对于ARGs，生物炭作为一种理想的填充剂，可调节水分含量，为堆肥混合物中的微生物提供最佳的气体环境和适宜的栖息地，可有效地提高堆肥处理中ARGs的去除效果。以水稻秸秆为原料制备的生物炭对ARGs的丰度没有明显的影响[9]；而CUI等[10]研究表明，蘑菇渣制备的生物炭可有效降低猪粪堆肥过程和产物中的ARGs；LI等[11]在鸡粪堆肥中添加不同比例竹炭，可使堆肥产物中ARGs减少21.6%～99.5%；钱勋[12]研究表明，添加生物炭可使堆肥产物中ARGs总丰度比对照低81%，生物炭降低了ARGs宿主菌的丰度从而导致ARGs降低。

然而，目前研究生物炭对土壤、底泥中抗生素的降解较多，将生物炭应用于猪粪好氧堆肥，分析其对猪粪中抗生素和ARGs削减的研究较少，关于不同生物炭对猪粪堆肥过程中抗生素及ARGs的削减规律仍需进一步探讨。本研究通过制备玉米秸秆生物炭(草本类生物炭)、竹炭(木本类生物炭)和猪粪生物炭(动物生物质类生物炭)，重点探讨添加3种不同类型生物炭对猪粪好氧堆肥过程中抗生素浓度及ARGs丰度的影响。该研究结果为不同情况下选择合适的生物炭提供理论指导，可以帮助管理粪便来源中由抗生素抗性引起的生态风险。

1 材料和方法

1.1 堆肥原料

新鲜猪粪取自苏州某养猪场，玉米秸秆粉末取自苏州某农田，竹子取自苏州某竹林，表1列出了堆肥原料的理化性质。堆肥添加的玉米秸秆生物炭、竹炭和猪粪生物炭的制备条件为600 ℃热解30 min，3种生物炭的元素组成和孔隙特征见表2、表3和图1。

图1 玉米秸秆生物炭、竹炭和猪粪生物炭的扫描电镜图

表1 材料的理化性质1)

表2 玉米秸秆生物炭、竹炭和猪粪生物炭的元素组成

表3 玉米秸秆生物炭、竹炭和猪粪生物炭的孔隙特征

1.2 试验设计

3种类型的生物炭添加量均为0.12 kg(堆体总质量的10%)，填装在堆肥罐内(聚氯乙烯材质，体积为5 L)。将反应器置于恒温水浴锅内，根据堆体内部的温度对恒温水浴锅进行阶段升温，以期模拟实际堆肥的自升温过程[13]。根据生物炭类型不同共设置3个处理组(CP为玉米秸秆生物炭-猪粪堆肥处理组，BP为竹炭-猪粪堆肥处理组，PP为猪粪生物炭-猪粪堆肥处理组)和1个空白对照组(CK为不添加生物炭堆肥处理组)，每个处理组均设置5个平行。堆肥反应持续60 d，每3天翻堆1次，每天17：00测量堆体温度和环境温度。根据堆体温度变化分别在堆肥1、7、15、45、60 d时采集样品，置于-20 ℃保存待测。

1.3 样品分析

1.3.1 理化性质测定

样品的C、H、O、N、S含量采用元素分析仪(Vario MAX)测定；pH用pH计(PHS-3E)测定，土水比为1 g∶5 mL；通过场发射扫描电子显微镜(S-4800)得到不同生物炭的形貌，利用比表面积及孔径分析仪(V-Sorb 2800P)和BET计算方法得到不同生物炭的比表面积、总孔体积和平均孔径。

1.3.2 抗生素的测定

样品的前处理采用固相萃取法(SPE)，处理过程主要参考文献[13]。本研究测定了堆肥中9种抗生素浓度，分别是3种四环素类抗生素(TCs)——四环素(TC)、土霉素(OTC)和强力霉素(DOX)，3种磺胺类抗生素(SAs)——磺胺嘧啶(SD)、磺胺二甲基嘧啶(SM2)和SMX，3种喹诺酮类抗生素(QNs)——恩诺沙星(ENR)、环丙沙星(CIP)和NOR，采用高效液相色谱仪(Ultimate 3000)—三重四极杆质谱仪(TSQ Quantum Ultra EMR)测定抗生素浓度[14]。

1.3.3 DNA提取和ARGs的定量

采用DNA提取试剂盒(FastDNA©SPIN Kit)提取堆肥样品微生物基因组DNA[15]。本研究定量分析了4种四环素类抗性基因(TRGs，包括tetA、tetC、tetG和tetX)、3种磺胺类抗性基因(SRGs，包括sul1、sul2和sul3)和1种喹诺酮类抗性基因(QRGs，qnrS)，这些ARGs的引物设计主要来源于文献[16]至文献[19]。

在实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR)仪(ABI 7500)上进行定量PCR反应，设置20 μL的反应体系：包括SYBR Premix Ex Taq酶溶液10 μL、前后引物(10 μmol/L)0.8 μL、ROX Reference Dye Ⅱ溶液0.4 μL、模板DNA(10 ng/μL)2 μL、双蒸馏水 6 μL。

反应结束后根据CT值(从基线到指数增长的拐点所对应的循环次数)来确定起始模板浓度，以拷贝数为横坐标，CT值为纵坐标绘制标准曲线。随后使用建立好的实时荧光定量PCR方法，对未知样品进行定量PCR，检测样品中ARGs拷贝数从而计算丰度，每个样品做3个技术重复。

2 结果与分析

2.1 添加不同生物炭对堆肥过程中抗生素浓度的影响

各处理组的抗生素总浓度均随着堆肥的进行不断降低，TCs、SAs和QNs的总浓度基本符合升温阶段(1 d)>高温阶段(7、15 d)>冷却阶段(45 d)>腐熟阶段(60 d)的变化规律(见图2)。其中，BP中抗生素的总质量浓度从312.45 μg/kg降到了8.90 μg/kg，降低了97%，效果最好；PP中抗生素的总质量浓度从311.84 μg/kg降到了28.60 μg/kg，降低了90%；CP中抗生素的总质量浓度从305.80 μg/kg降到了48.29 μg/kg，降低了84%。BP中TCs从195.72 μg/kg降到了3.70 μg/kg，SAs从58.71 μg/kg降到了3.70 μg/kg，QNs从58.02 μg/kg降到了1.50 μg/kg，TCs、SAs和QNs的去除率相比其他处理组均最高，分别为98%、94%和97%。PP中TCs从195.08 μg/kg降到了11.08 μg/kg，去除率达到94%，SAs从57.94 μg/kg降到了11.32 μg/kg，去除率仅有80%；而CP中3类抗生素的去除率均是各处理组中最低的，特别是SAs，去除率仅有74%。

注：字母不同代表样品之间有显著性差异(P<0.05)，图3同。

2.2 添加不同生物炭对堆肥过程中ARGs丰度的影响

各处理组的ARGs总丰度均随着堆肥的进行先上升后下降，TRGs、SRGs和QRGs的总丰度符合高温阶段(7、15 d)>冷却阶段(45 d)>升温阶段(1 d)>腐熟阶段(60 d)的变化规律(见图3)。其中，竹炭的添加使BP中ARGs的总丰度从1011.27拷贝数/g降到了1010.99拷贝数/g，降低了48%；qnrS的丰度降幅最大，从107.38拷贝数/g降到了105.90拷贝数/g，下降了97%；而sul3的丰度下降的最少，从109.53拷贝数/g降到了109.52拷贝数/g，仅下降了1%。猪粪生物炭的添加使PP中ARGs的总丰度从1011.26拷贝数/g降到了1011.07拷贝数/g，降低了36%；tetA的丰度降幅最大，从1010.65拷贝数/g降到了109.84拷贝数/g，下降了85%；而sul3的丰度降幅最小，从109.53拷贝数/g降到了109.52拷贝数/g，仅下降了2%。玉米秸秆生物炭的添加使CP中ARGs的总丰度从1011.26拷贝数/g降到了1011.15拷贝数/g，降低了23%；tetC的丰度降幅最大，从109.61拷贝数/g降到了108.84拷贝数/g，下降了83%；而tetG的丰度降幅最小，从1010.48拷贝数/g降到了1010.26拷贝数/g，仅下降了40%。

图3 堆肥过程中8种ARGs的丰度变化

然而，sul2在各处理组中的丰度均有上升并成为丰度最高的ARGs，竹炭的添加使得BP中sul2的丰度从1010.62拷贝数/g上升到1010.75拷贝数/g，升高了26%；玉米秸秆生物炭的添加使得CP中sul2的丰度从1010.57拷贝数/g上升到1010.94拷贝数/g，升高了57%；猪粪生物炭的添加使得PP中sul2的丰度从1010.55拷贝数/g上升到1010.78拷贝数/g，升高了41%。

3 讨 论

3.1 添加不同生物炭对猪粪堆肥过程中抗生素浓度的影响分析

还原性、稳定性、极性和芳香性的差异可能是3种生物炭吸附效率不同的主要原因，同时，在生物炭吸附抗生素过程中，通常不是单一机制，而是多种吸附机制的结合。吸附过程可分为外表面吸附和内表面吸附，主要由生物炭和抗生素芳香环组成的π-π EDA吸附抗生素[20]。

添加竹炭堆肥对抗生素的平均去除率最高。π-π EDA是竹炭吸附抗生素的一个重要机制，元素分析表明，竹炭的H/C最小，拥有更高的芳香环结构和更高的芳构化程度[21]。竹炭表面的羧基、硝基和酮基可充当电子受体，与抗生素形成π-π EDA从而增强了吸附效果，并且生物炭中不同类型的羟基和氨基也可作为π电子供体。孔隙填充也可看成是竹炭吸附抗生素的一个重要机制。抗生素在竹炭上的吸附可通过扩散到生物炭表面孔隙或未碳化馏分的有机物基质上而实现。竹炭具有较大的比表面积和较多的孔隙结构，可以提供较理想的物理吸附位点，使其表面能接触到较多的抗生素；同时增强了抗生素的内扩散，提高了吸附效率。另外，迅速上升的温度可以影响微生物群落，改变堆料性质，使抗生素降解。

添加玉米秸秆生物炭堆肥对抗生素的平均去除率最低，因为玉米秸秆生物炭具有较高的灰分和特殊的官能团结构，较大的孔径结构与TC、SD和ENR等抗生素不契合，这些抗生素被吸附后很快从炭孔中解吸[22]，造成玉米秸秆生物炭与抗生素之间的填充未充分发挥作用。其中π-π EDA、金属桥介导、表面络合作用是玉米秸秆生物炭吸附抗生素的主要机制，并可能存在阳离子交换。

添加猪粪生物炭堆肥对抗生素的去除具有选择性。疏水作用是生物炭吸附抗生素的另一个机制。通常，低表面氧化的生物炭具有疏水性，可通过疏水作用与疏水性有机化合物发生反应，从而达到削减抗生素的目的。猪粪生物炭具有较高的氧含量，在含氧官能团周围形成大量水分子簇导致其疏水性强[23]，而水分子簇与抗生素的竞争削弱了生物炭对部分抗生素的吸附能力。

3.2 添加不同生物炭对猪粪堆肥过程中ARGs丰度的影响分析

为了减少畜禽养殖中ARGs向环境中传播，好氧堆肥是一种削减粪便中ARGs丰度的重要技术。本研究中竹炭的添加使得BP中ARGs的总丰度降低了48%，效果最好；其中，qnrS的丰度降幅最大(97%)。竹炭能较好地降低qnrS的丰度是因为它能够大幅降低QRGs的运输[24]。但竹炭对ARGs的削减也具有选择性，例如竹炭不能很好地降低sul3的丰度，因为它拥有多孔结构，增大了微生物之间的空隙，可能会降低不同微生物之间的联系。因此，生物炭可能会通过降低基因水平转移作用从而减少部分ARGs在不同微生物之间的传播。猪粪生物炭的添加使ARGs的总丰度降低了36%，效果次之；其中，tetA的丰度降幅最大(85%)，而sul3的丰度仅下降了2%。玉米秸秆生物炭的添加使CP中ARGs的总丰度降低了23%，效果不佳；其中，tetC的丰度降幅最大(83%)。以上ARGs的削减可能源于生物炭的吸附解吸作用，该作用导致部分功能微生物出现衰亡，细胞裂解释放的DNA与胞外DNA同时被水解或生物降解；堆肥期间特定的温度、湿度和pH条件下，微生物体内功能性核酸酶的催化降解作用触发ARGs消解，DNA分子逐渐脱稳，部分双链分子结构逐渐转变为单链分子结构，同时，磷酸二酯键断裂，氢键稳定性降低，末端碱基脱落，均促进ARGs得到有效消解。

然而，sul2在各处理组中的丰度均有上升并成为丰度最高的ARGs，ZHANG等[25]和SELVAM等[26]认为sul2丰度的增加与微生物群落结构的差异有关，这可能是由于生物炭携带了上述基因或为其宿主菌提供了良好的繁殖环境，因此丰度升高。本研究中添加玉米秸秆生物炭堆肥中sul2的丰度增幅最大(57%)，这与WANG等[27]的研究一致，玉米秸秆生物炭能增加动物粪便高温堆肥中sul2的丰度。添加竹炭堆肥中sul2的丰度增幅最小(26%)，温度可能是影响sul2变化的重要因素[28]，以此推断本研究中添加竹炭的堆体温度适宜，在一定程度上抑制了sul2丰度的升高。

4 结 语

本研究对比添加不同生物质来源的生物炭对堆肥过程中抗生素及ARGs的影响，发现添加竹炭堆肥对猪粪中抗生素及ARGs的降解效果最佳，实现了木本类生物炭的高附加值利用，同时也实现了畜禽粪便的资源化利用，降低了畜禽粪便中残留的抗生素及ARGs带来的生态风险。

本研究为不同情况下选择合适的生物炭提供理论指导，但生物炭对堆体中抗生素及其ARGs削减机制还需进一步研究，堆体中微生物群落的变化与抗生素、ARGs削减规律的联系，抗生素降解菌与ARGs潜在宿主微生物的贡献需要重点关注。