等离子体处理对4种草莓病原真菌的室内毒力测定

关兆英，马玉超，庞婧珺，孙运金，闫 哲*，尚巧霞*

(1.北京农学院生物与资源环境学院/农业农村部华北都市农业重点实验室，北京 102206；2.北京农学院首都农产品安全产业技术研究院等离子体工程中心，北京 102206)

草莓(Fragariaspp.)为蔷薇科草莓属多年生草本植物[1]。由于其形美味甜，且富含氨基酸、矿物质及维生素C等多种营养物质，深受广大消费者喜爱[2]。近年来，中国草莓栽培面积逐年扩大，但草莓根腐病、枯萎病、炭疽病、灰霉病等病害在生产中时常发生[3]，如果防治措施不得当或不及时，可能会严重影响草莓产量和品质。已报道的草莓根腐病的病原菌达20多种，主要有镰孢属Fusarium、炭疽菌属Colletotrichum、丝核菌属Rhizoctonia等真菌，其中由立枯丝核菌Rhizoctoniasolani引起的草莓根腐病是影响草莓生产的重要病害之一，发病初期从幼根前端或中部变成褐色或黑褐色，不定根的中间部位表皮坏死，病健交界明显，被侵染的植株长势弱，叶片变黄，分蘖减少，结果减少，严重时维管束褐变、坏死，整株植株萎蔫，最后枯死[4]；草莓枯萎病是由尖孢镰刀菌Fusariumoxysporum引起的，发病的草莓植株心叶黄化，伴有畸形叶产生，轻者导致病株生长衰弱，结果率低，果实瘦小，果实口感变差，严重时导致匍匐茎减少，整株枯萎至死亡[5]；草莓炭疽病的病原菌主要为胶孢炭疽菌Colletotrichumgloeosporioides，在草莓育苗期和移栽存活期发病最严重，常常危害短缩茎、匍匐茎和叶柄，造成大量烂苗、死苗现象[6]；草莓灰霉病是由灰葡萄孢菌Botrytiscinerea引起的草莓开花结果期和采后的重要病害，该病可以危害花器和果实，也可危害叶片，受危害的花器和果实腐烂，受害的叶片呈“倒V字”形[7]。目前草莓病害防治仍以化学防治为主[8]，可持续的绿色农业综合防治措施有待完善。等离子体技术作为一项现代物理技术，具有处理速度快、操作简单、杀菌高效和环境友好等优点[9-10]，可杀死多种类型的抗性细菌细胞、真菌类病原菌、芽孢、病毒和酵母菌等[11]，还能激发种子的萌发潜能，提升种子的生命活力，提高产量和质量[12]，近年来越来越广泛应用于农业生产，但是在植物病害防治上应用较少。鉴于此，该研究利用等离子体技术，对4种常见的草莓病原真菌：灰葡萄孢菌Botrytiscinerea、尖孢镰刀菌Fusariumoxysporum、立枯丝核菌Rhizoctoniasolani、胶孢炭疽菌Colletotrichumgloeosporioides的抑菌效果和敏感性进行测定，旨在了解、探索等离子体处理对草莓真菌病害的防治潜力，为科学合理的利用等子体技术防治植物病害提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 供试病原真菌 灰葡萄孢菌Botrytiscinerea、尖孢镰刀菌Fusariumoxysporum、立枯丝核菌Rhizoctoniasolani、胶孢炭疽菌Colletotrichumgloeosporioides，这4种草莓病原真菌均由北京农学院病理实验室提供，选用PDA培养基，经活化培养后于4 ℃冰箱中保存。

1.1.2 试验仪器 放电等离子体由北京农学院食品科学与工程学院自制，如图1所示[13]。

注：1是样品放置台；2是电子喷射口；3是距离刻度线，由下至上为0-7 cm；4是电介质管；5和6是正负直流电压；7是功率显示屏；8是功率调节器；9是开关。Note: 1 is the sample placement table; 2 is the electron injection port; 3 is the distance scale, which is 0-7 cm from bottom to top; 4 is the dielectric tube; 5 and 6 are positive and negative DC voltages; 7 is the power screen; 8 is the power regulator; 9 is the switch.图1 放电等离子体示意图Fig.1 The schematic diagram of plasma

1.2 试验方法

采用菌丝生长速率法[14]测定等离子体处理对菌丝生长的抑制率。用直径5 mm灭菌打孔器，分别在活化后的4种草莓病原真菌菌落边缘打孔，并将菌饼接种于PDA平板上，再将平板放置在等离子体的样品放置台上，在室温、空气的条件下，将等离子体调节放电功率400 W，处理1、3、5和7 min，重复3次，以不进行处理作为空白对照。放入28 ℃恒温箱中培养2～5 d。采用十字交叉法测量菌落直径，计算菌丝生长抑制率[15]。

菌丝生长抑制率=(对照菌落直径-处理菌落直径)/(对照菌落直径-菌饼直径)×100.00%。

1.3 数据处理

菌落扩展直径和菌丝生长抑制率用SPSS 21.0软件进行方差分析和差异显著性分析。将菌丝生长抑制率转换成抑制几率值(y)，等离子体处理时间(min)转换成质量时间对数(x)，计算毒力回归方程：y=ax+b(a表示回归系数，b为常数)，并以回归方程计算等离子体处理对4 种草莓病原真菌的半数致死时间(LT50) 及相关系数(R)。

2 结果与分析

2.1 等离子体处理对4种草莓病原真菌的抑制率

等离子体处理7 min，对4种草莓病原真菌均具有显著的杀菌作用(表1)，4种草莓病原真菌的菌落扩展直径都为0.00 cm，抑制率为100.00%。而另外3个等离子体处理时间对4种草莓病原真菌也具有不同程度抑制菌丝生长的作用，且处理的草莓病原真菌菌落扩展直径均小于对照。其中等离子体处理1 min，对4种草莓病原真菌的抑制效果均不明显，菌落扩展直径范围(4.32±0.16) cm～(7.08±0.08) cm，抑制率1.78%～19.49%；处理3 min，对灰葡萄孢菌的抑制效果显著，抑制率达到100.00%，达到杀菌效果，对另外3种草莓病原真菌抑制效果不显著；处理5 min，对立枯丝核菌的抑制效果显著，抑制率达到100.00%，达到杀菌效果，对另外2种草莓病原真菌抑制效果不显著。

表1 等离子体处理对4种草莓病原真菌的抑制比较Tab.1 Comparison of inhibition rates of plasma treatment on 4 strawberry pathogenic fungi

2.2 等离子体处理对不同病原真菌的敏感性测定

等离子体处理对4个草莓病原真菌毒力回归方程及LT50值计算统计结果如表2所示。等离子体处理对灰葡萄孢菌菌丝生长抑制作用时间最短，LT50为1.670 min；对立枯丝核菌抑制作用时间次之，LT50为2.673；对尖孢镰刀菌和胶孢炭疽菌抑制作用时间较长，LT50分别是4.204和4.668。

3 讨 论

草莓市场种植效益高，需求日益增加，但目前存在的化肥农药过度使用、各种草莓病害频繁发生等问题影响着草莓的生产发展[16]。农业预防是控制草莓病害的基本措施，可以减少病害的发生，提高草莓的产量、质量和经济效益[17]。目前,草莓病害的主要防治手段仍然是化学防治，因其防治对象广泛,可以快速有效进行防治,但是使用不当很容易引起人类和动物中毒,环境污染,产生药害[18]。为了弥补化学农业(化肥、农药)和生物农业(有机农业)的不足，现代物理技术被越来越多的应用到农业生产中。等离子体技术作为一项新兴的高能物理技术，可以调控作物生长、保持和提高作物产量品质等，且不会对环境造成污染，生态意义明显，适用于设施农业和作物的工厂化生产，具有良好应用前景。

表2 等离子体处理对4种草莓病原真菌的室内敏感性比较Tab.2 Comparison of sensitivity of plasma treatment to 4 strawberry pathogenic fungi

目前，关于等离子体处理对于植物病原真菌直接的生长抑制作用研究鲜有报道。王卓等[19]研究发现，等离子体处理可降低蓝莓果实表面真菌数量，具有杀菌效果。ZAHORANOVA等[20]发现，等离子体处理可将接种于小麦种子表面的致病性镰刀菌全部杀灭。该研究发现等离子体处理对4种草莓病原真菌有很好的抑制效果，且随着时间的适当增加，抑制效果越来越好，处理7 min后抑制率都可达到100.00%；其中对灰葡萄孢菌的抑制效果最好，LT50为1.67 min，处理3 min抑制率达到100.00%。将等离子体技术应用到草莓病害防治乃至其他作物病害防治都具有重要的潜在应用价值。

目前，等离子体处理对植物病原真菌抑制作用的研究尚处在探索阶段，有很多机理还有待进一步研究。该试验对4种草莓病原真菌进行处理，均能达到100.00%的抑制效果。该试验结果是在室内测定的，其田间防效受多因素影响，是否与室内结果一致，有待进一步验证。另外，等离子体处理对植物病原真菌和植物生长的影响是复杂的过程，处理其他植物病原真菌的效果和对植物的影响及其详细的作用机理等问题还有待于更加深入的研究。