毒害艾美耳球虫早熟株对鸡免疫效果的评价

马维彩，何学柏#，孙英健，李本胜，张彩荣，芮国红，李焕荣*，李秋明*

(1.北京农学院动物科学技术学院/兽医学(中医药)北京市重点实验室，北京 102206；2. 北京市华都峪口禽业有限责任公司，北京 101206)

鸡球虫病是由一种或多种艾美耳球虫感染引起的肠道疾病[1]，其中毒害艾美耳球虫(Eimerianecatrix)易感染 56～126日龄的鸡，发病率和死亡率最高可达80%[2]，患病鸡主要表现食欲下降、血便、饲料转化率降低、生长发育受阻，蛋鸡产蛋量下降[3]。 据估计2016年全球鸡球虫病的名义经济成本超过了10.4亿英镑，主要包括治疗、死亡和控制成本[4]。从20世纪40年代开始，几种磺胺类药物被用作抗球虫药物，随后又推出一系列合成和离子载体药物产品[5]。虽然抗球虫药物在控制球虫病方面发挥了巨大作用, 但由于抗球虫药物的长期使用,导致针对不同抗球虫药物的耐药性球虫的出现,从而引起了越来越严重的抗球虫药物耐药性问题[6]。而近年来由于耐药虫株的产生及抗球虫药限制使用等规定[7]，使得球虫病的防治再次陷入困境。相对抗球虫药而言，鸡球虫疫苗是预防鸡球虫病最理想的一种方法，具有操作简单、费用低等优点。随着球虫强毒苗广泛的使用，逐渐出现如安全性差、免疫反应大和影响生产性能等难以克服的缺点，进而研究人员通过压力选择研制卵囊排出最小潜在期缩短或裂殖生殖缺失一代最终导致毒力相对减弱的早熟虫株疫苗。研究发现，早熟株疫苗具有稳定、高效、对动物生产性能影响较小，可诱导动物机体产生较强的免疫力和保护力等优点。该研究通过毒害艾美耳球虫(Eimerianecatrix)早熟株对鸡进行2次免疫，然后在鸡不同日龄接种毒害艾美耳球虫亲本株，检测免疫相关指标综合评价抗球虫效果，为获得安全和有效的鸡球虫疫苗株提供试验参考依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

1日龄鸡购自北京市华都峪口禽业有限责任公司，盐酸氨丙啉购自惠康动物药业有限公司，毒害艾美耳球虫(Eimerianecatrix)亲本株和毒害艾美耳球虫(Eimerianecatrix)早熟株由北京农学院动物科学技术学院球虫实验室保存。试验已通过北京农学院动物福利与伦理审查，编号BUA2021040。

1.2 方 法

1.2.1 试验鸡分组和免疫处理 无球虫条件下育1日龄鸡备用，取4日龄健康、体质量50～70 g鸡随机分为对照组、盐酸氨丙啉添加组、一免组和二免组，每组50只鸡地面饲养，试验期81 d。对照组、免疫组(免疫组包括一免组和二免组)鸡饲喂基础日粮，盐酸氨丙啉添加组鸡按照药物说明全程基础日粮加盐酸氨丙啉拌服。采用的日粮为无抗生素添加的基础日粮(表1)。一免组鸡4日龄一免，剂量1 000个/只毒害艾美耳球虫早熟株孢子化卵囊；二免组鸡53日龄二免，剂量200个/只毒害艾美耳球虫早熟株孢子化卵囊。

表1 基础日粮组成及营养水平Tab.1 Composition and nutritional level of the basic diet

在鸡25日龄、53日龄、74日龄时从地面饲养的各组随机抽取6只鸡移到笼上饲养，同时设置红对照组(鸡不免疫不喂药仅攻毒)。笼养鸡除对照组外，其他试验组鸡均攻毒，攻毒方法为逐只鸡经口接种毒害艾美耳球虫亲本株(10×104个孢子化卵囊/只)。免疫组鸡自免疫后第7天每天检测每克粪便中的卵囊数(oocyst per gram，OPG)，直到试验结束。

1.2.2 饲养管理 鸡饲养在北京农学院鸡球虫实验室，试验前对鸡舍进行全面冲刷、消毒。饲养期间，自然光照加人工补光，光照强度30 Lx，1～7日龄每天光照24 h，8日龄后每天光照23 h、黑暗1 h。鸡舍温度第1天到第7天33～35 ℃，之后每7 d下降2 ℃，至25 ℃不再下降。每天定时饲喂1次，自由采食、自由饮水，注意鸡舍卫生及合理通风。

1.2.3 相关检测指标的测定 试验期间肉眼观察和记录各组鸡的精神状态、采食、饮水、活动状况及粪便情况，并在鸡25日龄、53日龄、74日龄攻毒当天和攻毒后第7天称取体质量，计算鸡相对体增质量、存活率、小肠病变记分、小肠病变记分减少率(reduction in lesion scores，RLS)、卵囊数、卵囊减少率和抗球虫指数(anticoccidiosis index，ACI)。

平均体增质量=平均终期体质量―平均初期体质量

相对平均体增质量率=试验组鸡平均体增质量/对照组鸡平均体增质量×100%

(1)

存活率=组内存活鸡只数/试验前组内总鸡只数×100%

采用麦克马斯特氏计数法计算每克盲肠粪便卵囊数，根据陈春林等[8]提供的方法对卵囊值进行统计。

卵囊减少率=(红对照组卵囊平均产量-试验组卵囊平均产量)/红对照组卵囊平均产量×100%

(2)

小肠病变记分按文献[9]标准计算。

病变值=各组鸡小肠平均病变记分×10

小肠病变记分减少率=(红对照组小肠平均病变记分-试验组小肠平均病变记分)/红对照组小肠平均病变记分×100%

(3)

公式(1)和(2)及(3)中试验组分别指盐酸氨丙啉添加组、一免组和二免组。

抗球虫指数(ACI)=(存活率+相对平均体增质量率)×100%―(病变值+卵囊值)。

其判定标准[10]ACI<120为疗效差，120≤ACI<160为疗效中等，160≤ACI<180为疗效良好，ACI≥180为疗效优秀。

1.3 统计分析

试验数据采用 Graph pad Prism 8.0软件One-Way ANOVA分析组间差异，其中P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著，P>0.05表示差异不显著。

2 结 果

2.1 鸡免疫毒害艾美耳球虫早熟株后的临床表现

肉眼观察试验期间鸡状态和25日龄、53日龄、74日龄鸡攻毒后5～7 d血便情况。整个试验期间对照组鸡精神状态良好，采食、饮水正常，被毛整齐，未出现任何临床症状。25日龄、53日龄、74日龄鸡攻毒后第4天，红对照组鸡开始出现精神萎靡、食欲不佳、饮水下降、扎堆，第5天到第7天出现血便连片；攻毒后第7天其中53日龄鸡出现死亡；25日龄、53日龄、74日龄鸡攻毒后第5天，盐酸氨丙啉添加组鸡表现精神萎靡、扎堆、饮水和食欲均下降，并出现大量血便；25日龄、53日龄、74日龄鸡攻毒后一免组和二免组鸡食欲与饮水稍微下降、鸡只出现少量血便，至第6天逐渐恢复正常。

2.2 鸡免疫毒害艾美耳球虫早熟株后对体质量的影响

25日龄、53日龄、74日龄鸡攻毒后第7天，盐酸氨丙啉添加组和免疫组鸡平均体增质量均明显低于对照组但显著或极显著高于红对照组，二免组高于一免组(图1)；免疫组和盐酸氨丙啉添加组相比，25日龄鸡攻毒后免疫组平均体增质量明显高于盐酸氨丙啉添加组，在53日龄和74日龄鸡攻毒后免疫组平均体增质量显著低于盐酸氨丙啉添加组。

2.3 鸡免疫毒害艾美耳球虫早熟株后的免疫保护

毒害艾美耳球虫早熟株免疫后鸡的存活率、小肠病变记分、小肠病变记分减少率和抗球虫指数见表2。试验周期内除53日龄鸡攻毒后红对照组有2只鸡死亡外，其余各组鸡均无死亡；免疫组鸡小肠平均病变记分均低于红对照组，小肠病变记分减少率高于红对照组，其中二免组不同日龄鸡(25日龄、53日龄、74日龄)攻毒后鸡小肠平均病变记分均低于一免组，小肠病变记分减少率均高于一免组，且74日龄鸡攻毒后小肠病变记分减少率最高；不同日龄鸡攻毒后盐酸氨丙啉添加组和免疫组抗球虫指数极显著高于红对照组，鸡在25日龄攻毒后免疫组抗球虫指数高于盐酸氨丙啉添加组，但在53日龄和74日龄攻毒后免疫组的抗球虫指数低于盐酸氨丙啉添加组，然而二免组不同日龄鸡抗球虫指数均高于145且高于一免组，即二免组鸡抗球虫效果达到中效水平。

注：与对照组相比，#表示差异显著(P<0.05)，##表示差异极显著(P<0.01)；红对照组与其他组相比，*表示差异显著(P<0.05)，**表示差异极显著(P<0.01)。Note: Compared with the control group,# indicates significant difference (P<0.05), ## indicates extremely significant difference (P<0.01); Compared with the red control group , * indicates significant difference (P<0.05), ** indicates extremely significant difference (P<0.01). 图1 不同日龄鸡免疫毒害艾美耳球虫早熟株体质量变化Fig.1 The weight gain of chicks immunized Eimeria necatrix precocious strains with different days

表2 鸡免疫毒害艾美耳球虫早熟株后的免疫保护Tab.2 The immune protection of chickens immunized with precocious strains of Eimeria necatrix

2.4 鸡免疫毒害艾美耳球虫早熟株后对卵囊产出的影响

采用麦克马斯特氏计数法计算鸡每克盲肠粪便中的卵囊数(表3)。在不同日龄攻毒后红对照组鸡卵囊数均显著高于盐酸氨丙啉添加组和免疫组，其中25日龄攻毒后免疫组鸡卵囊数均明显低于盐酸氨丙啉添加组，53日龄攻毒后免疫组鸡卵囊数均显著高于盐酸氨丙啉添加组，74日龄攻毒后免疫组鸡卵囊数极高于盐酸氨丙啉添加组且一免组高于二免组；免疫组25日龄鸡卵囊减少率极显著高于盐酸氨丙啉添加组且高达85%以上，免疫组53日龄和74日龄鸡卵囊减少率低于盐酸氨丙啉添加组，但二免组74日龄鸡卵囊减少率高于一免组且高达90%。

感染毒害艾美耳球虫后第7天到第81天一免组与二免组鸡排出粪便中卵囊数变化情况见图2。在感染后的第128 小时各感染组鸡粪便中均检测到卵囊，一免组和二免组鸡在7～56 d间鸡卵囊排出量变化不大，在60～77 d间二免组鸡卵囊排出量明显高于一免组，且在65 d鸡排出卵囊量出现小高峰。表明2次人工免疫可延长卵囊排出时间,即延长免疫保护时间。

表3 鸡免疫毒害艾美耳球虫早熟株后对卵囊产出的影响Tab.3 The production of coccidial oocysts from chickens immunized with Eimeria necatrix precocious strain

图2 鸡免疫毒害艾美耳球虫早熟株后的卵囊数变化Fig.2 Changes of oocyst numbers in chickens immunized with Eimeria necatrix precocious strain

3 讨 论

不同种艾美耳球虫诱导的免疫强度和持续时间因其生物学特性和免疫方法的不同而不同，在7种鸡艾美耳球虫中毒害艾美耳球虫的免疫保护力最弱，至少需要3个生命周期才能逐步建立对致病性毒害艾美耳球虫的免疫保护[11]。该试验采用毒害艾美耳球虫早熟株2次免疫鸡(4日龄一免，53日龄二免)，并于免疫后3次接种毒害艾美耳球虫亲本株(25日龄、53日龄、74日龄)，通过检测免疫保护相关指标评价毒害艾美耳球虫早熟株对鸡的免疫效果。在25日龄、53日龄、74日龄攻毒后，免疫组鸡表现较强的免疫保护力，即与红对照组相比，相对体增质量显著升高、鸡小肠病变记分显著下降、盲肠粪便中卵囊数明显减少。另外，与25日龄攻毒相比，53日龄攻毒后红对照组鸡出现死亡，相对体增质量最低、肠道病变程度最严重和抗球虫指数最低，这也表明53日龄左右是毒害艾美耳球虫易感日龄；在74日龄攻毒后一免组鸡无抗球虫效果，二免组鸡抗球虫效果达中效，且二免组鸡小肠病变记分和卵囊数低于前2次攻毒。

在研究鸡球虫早熟株的免疫效果时, 罗鹏[12]和李瑞琪等[13]发现2次免疫的效果优于只进行1次免疫，与该试验结果相同。研究表明，鸡体一免后其体内产生的抗体可在一段时间内提供足够的免疫保护力[13]，但是体内抗体会随着时间延长而逐渐降低以至于消失，为了使机体内的抗体水平恢复，则需要在合适时间进行第2次免疫，从而延长免疫保护力。该试验选择一免后第49天(53日龄)进行二免，二免组鸡获得良好的免疫力。球虫病康复鸡对再感染球虫有抵抗力，但若缺乏再次感染，随饲养时间延长鸡对球虫的免疫力会减弱，这是因为免疫次数少产生免疫抗体滴度低，不能很好的预防球虫病，而2次免疫可使抗体水平迅速提高，且免疫产生的抑制期较短[14]。有研究报道，雏鸡在严格无球虫的环境中饲养，免疫接种球虫活卵囊后鸡的免疫力随着时间延长而下降，但若再次免疫接种后免疫期将会延长，免疫力亦有所增强[15]。事实上，鸡球虫免疫是一种典型的局部带虫免疫，卵囊的反复感染是形成免疫保护力的必要条件，且随时间变化而呈现一定程度的波动[11]。