苍术高效液相色谱指纹图谱的建立

白悦然，赵世津，傅业全，王建舫

(北京农学院兽医学(中医药)北京市重点实验室/动物类国家级实验教学示范中心，北京 102206)

苍术为菊科植物茅苍术(Atractylodeslancea(Thunb.) DC.)或北苍术(Atractylodeschinensis(DC.) Koidz.)的干燥根茎，春季、秋季采挖，除去泥沙，晒干，撞去须根[1]。茅苍术主要分布于江苏、湖北、河南、安徽、浙江、江西等省；北苍术主要分布于内蒙古、河北、山西、辽宁、吉林、黑龙江等省区[2]。2020版《中国药典》苍术药材质量评价仅以苍术素含量作为标准，中药指纹图谱具有特征性、整体性、模糊性等特点，可充分反映中药复杂体系中各成分的整体状况，是目前中药质量控制较有效的手段之一[3]。苍术色谱指纹图谱的方法分为薄层色谱指纹图谱[4-5]、气相色谱指纹图谱[6]和高效液相色谱指纹图谱(high performance liquid chroma-tography，HPLC)[7-13]等。高效液相色谱指纹图谱能更全面准确反映苍术药材各成分的状况，其方法中使用的流动相分为酸性[7-9]和中性[10-13]，其中酸性流动相更有利于苍术中酸性成分的分离，中性流动相更有利于苍术中性成分的分离，而苍术中的酸性成分总量较少，中性成分含量较多，故该试验采用中性流动相。该试验旨在建立18批苍术药材的高效液相色谱指纹图谱，并对结果进行聚类分析和主成分分析，以期为苍术药材质量评价提供试验依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料和仪器

白术内酯I对照品(批号为P08J9F50979)和(4E,6E,12E)-十四碳三烯-8,10-二炔-1,3-二乙酸酯对照品(批号为M28J12S138942)均购自上海源叶生物科技有限公司。苍术素对照品(批号为19072205)，购自成都普菲德生物技术有限公司。苍术样品经北京农学院园林学院田晔林鉴定，详情见表1。

试验仪器按照文献[14]配备。

表1 18批苍术样品信息来源Tab.1 Information sources of 18 batches of Atractylodis Rhizoma

1.2 色谱条件

艾杰尔-飞诺美Venusil MP C18色谱柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)。流动相为水、甲醇和乙腈，梯度洗脱，洗脱程序见表2。检测波长270 nm，流速1.0 mL/min，柱温30 ℃，进样量10 μL。

表2 洗脱程序Tab.2 Elution procedure

1.3 溶液的配制

1.3.1 混合对照品溶液的制备 取白术内酯I对照品、(4E,6E,12E) -十四碳三烯-8,10-二炔-1,3-二乙酸酯对照品、苍术素对照品适量，置于10 mL棕色容量瓶中，加甲醇定容，摇匀，用0.22 μm的有机滤膜过滤，即可。

1.3.2 苍术样品溶液的制备 取苍术药材粉末，用孔径270 μm滤网过滤，精密称定，置50 mL具塞锥形瓶中，精密加入甲醇10 mL，密塞，称定，超声处理(功率250 W，频率40 kHz)，40 ℃，1 h，放冷，再称定，用甲醇补足损失的质量，摇匀，用孔径74 μm滤网过滤，用孔径0.22 μm的有机滤膜过滤，即可[14]。

1.4 方法学考察

方法学考察参考文献[9,15]。

1.4.1 日内精密度试验 取第8批苍术样品溶液，连续进样6 次，记录色谱图，对所得色谱图进行数据分析。

1.4.2 日间精密度试验 取第8批苍术样品溶液，分别在0、24、48、72和96 h进样，记录色谱图，对所得色谱图进行数据分析。

1.4.3 重复性试验 取第8批苍术样品溶液6份，记录色谱图，对所得色谱图进行数据分析。

1.5 指纹图谱的建立及相似度分析

指纹图谱的建立及相似度分析参考文献[13,16-18]。混合对照品溶液和18批苍术样品溶液，按照“1.2”进样，用Empower 2软件导出AIA 格式色谱图。相似度评价采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”软件( 2012 版)。把第1批苍术样品的色图谱设为参照图谱，采用中位数法，时间窗宽度0.5 min，进行色谱峰匹配。

1.6 聚类分析

聚类分析参考文献[19-24]。以18批苍术样品的峰面积为变量，利用SPSS20.0 进行聚类分析。

1.7 主成分分析

主成分分析参考文献[19-27]。以18 个共有峰峰面积为变量，利用SPSS20.0 进行主成分分析。

2 结果与分析

2.1 方法学考察

2.1.1 日内精密度试验 取第8批苍术样品溶液，连续进样6次，相似度均大于0.99，白术内酯I和苍术素的保留时间的相对标准偏差分别为0.07%和0.10%，峰面积相对标准偏差分别为1.33%和1.25%。日内精密度良好。

2.1.2 日间精密度试验 取第8批苍术样品溶液，分别在0、24、48、72和96 h进样，相似度均大于0.99，白术内酯I和苍术素的保留时间相对标准偏差分别为0.19%和0.36%，峰面积相对标准偏差分别为2.42%和1.48%。日间精密度良好。

2.1.3 重复性试验 取第8批苍术样品溶液6份进行测定，相似度均大于0.98，白术内酯I和苍术素的保留时间相对标准偏差分别为0.10%和0.13%，峰面积的相对标准偏差分别为2.41%和1.37%。重复性良好。

2.2 指纹图谱的建立及相似度评价

2.2.1 指纹图谱的建立 将第1批苍术样品的色谱图设为参照图谱，进行色谱峰匹配，得到图1的指纹图谱，在横坐标保留时间5 min和70 min范围内共出现了18个共有峰。

2.2.2 共有峰确认和参照峰的选择 将已确定的18个共有峰与混合对照品的色谱峰进行比较，指认了3个色谱峰，分别为白术内酯I( 13 号峰)、(4E,6E,12E)-十四碳三烯-8,10-二炔-1,3-二乙酸酯( 14 号峰)、苍术素( 15 号峰)，见图 2。

图1 18批苍术样品的HPLC指纹图谱Fig.1 HPLC fingerprints of 18 batches of Atractylodis Rhizoma

注：13是白术内酯I；14是(4E,6E,12E) -十四碳三烯-8,10-二炔-1,3-二乙酸酯；15是苍术素。Note:13 is atractylenolide I；14 is 4e, 6e, 12e-tetradecatriene-8,10-diyne-1,3-diacetate; 15 is atractylodin.图2 苍术样品(A)和混合对照品(B)HPLC图谱Fig.2 HPLC chromatograms of Atractylodis Rhizoma sample(A)and mixed reference substances(B)

2.2.3 相似度评价 18批苍术样品的相似度在0.479～0.984之间(表3)。其中，S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S8、S9、S10、S11、S14、S17和S18之间的相似度均大于等于0.811。S12除与S16的相似度达到0.945外，与其他批次的相似度均小于等于0.830。S13除与S15的相似度为0.983外，与其他批次的相似度均小于等于0.826。

表3 18批苍术样品相似度评价结果Tab.3 Similarity evaluation results of eighteen batches of Atractylodis Rhizoma samples

2.3 聚类分析

18批苍术样品HPLC指纹图谱中的峰面积经标准化处理后，运用SPSS 20.0进行聚类分析，选择以组间连接作为聚类方法，度量标准选择平方 Euclidean 距离，绘制树状图，所得聚类分析结果见图3。当分类距离为20时，苍术样品分为2类，S12和S16聚为一类，S1～S11、S13～S15、S17和S18聚为一类。当分类距离为10时，苍术样品分为3类，S12和S16聚为一类，S13和S15聚为一类，S1～S11、S14、S17和S18聚为一类。当分类距离为5时，苍术样品分为6类，S12和S16聚为一类，S13和S15聚为一类，S5和S17聚为一类，S7～S10聚为一类，S3、S6、S14、S18聚为一类，S1、S2、S4、S11聚为一类。

图3 18批苍术样品的聚类分析树状图Fig.3 Cluster analysis dendrogram of 18 batches of Atractylodis Rhizoma

2.4 主成分分析

将18批苍术样品的18个共有峰峰面积导入 SPSS 20.0 统计软件进行主成分分析，以特征值1为提取标准，筛选得到5个主成分(见表4和图4)。主成分1是5.917，主成分2是4.226，主成分3是2.885，主成分4是1.617，主成分5是1.219；这5个主成分的方差贡献率依次为32.875%、23.477%、16.029%、8.986%和6.772%，主成分5的累计方差贡献率达88.139%。

图4 苍术成分陡坡图Fig.4 Scree plot of Atractylodis Rhizoma compoment

主成分1和峰1、峰3、峰4、峰6、峰7、峰11、峰16及峰17 的关系较为密切；主成分2和峰5、峰12、峰14、峰15及峰18的关系密切，峰14为(4E,6E,12E)-十四碳三烯-8,10-二炔-1,3-二乙酸酯、峰15为苍术素；主成分3和峰8、峰9、峰10、峰13及峰14的关系密切，峰13为白术内酯I、峰14为(4E,6E,12E)-十四碳三烯-8,10-二炔-1,3-二乙酸酯；主成分4和峰2及峰17的关系密切；主成分5和峰10的关系密切(表5)。

表4 苍术主成分特征值和方差贡献率Tab.4 Eigenvalue and variance contribution rate of Atractylodis Rhizoma compoment

3 讨 论

试验过程中发现，苍术样品经粉碎，常温保存7 d后，苍术样品中的苍术素含量减少，可能是苍术样品粉末中的挥发油成分容易挥发出来，而经甲醇萃取后，4 ℃避光保存，90 d后，苍术样品中的苍术素含量基本没有变化。

该试验采用二极管阵列检测器进行了190～400 nm全波长扫描。在270 nm波长处所得的色谱峰信息较为全面，可识别的化合物种类较丰富，故选择270 nm作为检测波长。试验先后对0.1%磷酸-乙腈、水-乙腈和水-甲醇-乙腈作为流动相进行考察，水-甲醇-乙腈作为流动相时，出峰较多，峰型较好，且白术内酯I和苍术素峰均得到了较好的分离。

表5 苍术主成分的载荷矩阵Tab.5 Component matrixa of Atractylodis Rhizoma compoment

苍术样品S12和S16相似度为0.945，聚为一类；S13和S15相似度为0.983，聚为一类；S5和S17相似度为0.978，聚为一类；S7～S10之间的相似度均大于等于0.948，聚为一类；S3、S6、S14、S18之间的相似度均大于等于0.911，聚为一类；S1、S2、S4、S11之间的相似度均大于等于0.947，聚为一类。可见，当分类距离为5时，相似度需大于或等于0.911才能聚为一类。当分类距离为10时，S7～S10；S3、S6、S14、S18；S1、S2、S4、S11聚为一类，最小相似度为0.811。当分类距离为20时，S7～S10；S3、S6、S14、S18；S1、S2、S4、S11；S5、S17；S13、S15聚为一类，最小相似度为0.628。总之，不同批次的苍术样品的相似度越高，聚为一类的可能性越大，聚类的分类距离越小。

关于苍术指纹图谱色谱峰的指认，詹丹丹[7]指认了原儿茶酸、原儿茶醛、咖啡酸、阿魏酸、熊果酸、绿原酸等酸性成分，而没有指认出白术内酯I、(4E,6E,12E)-十四碳三烯-8,10-二炔-1,3-二乙酸酯、苍术素，可能因为詹丹丹用的酸性流动相，而酸性流动相更有利于酸性成分的分离。该试验用的中性流动相，苍术中的酸性成分在2 min 内很快被洗脱下来，所以没有检测到酸性成分。研究人员[8-9,13]分别建立了苍术麸炒前后的指纹图谱，并在270 nm处指认了苍术素醇、(4E,6E,12E)-十四癸三烯-8,10-二炔-1,3-二乙酸酯和苍术素[8-9]；在254 nm处指认了共有峰白术内酯Ⅱ，邻苯二甲酸二异丁酯、苍术素[13]。该试验在苍术指纹图谱标定的18个共有峰中，确认了3个，分别为白术内酯I、(4E,6E,12E)-十四碳三烯-8,10-二炔-1,3-二乙酸酯、苍术素。结合主成分分析可知，白术内酯I归属于主成分3，(4E,6E,12E)-十四碳三烯-8,10-二炔-1,3-二乙酸酯归属于主成分2和主成分3，苍术素归属于主成分2。

该试验建立了苍术 HPLC 指纹图谱，发现18个共有峰，指认了其中3个，初步反映了苍术整体化学特征，检测方法简单可行，重复性、稳定性良好，同时结合聚类分析和主成分分析多方面评价苍术质量，为苍术整体质量控制提供了比较全面的评价模式。