GAS5靶向miR-128调控帕金森病模型细胞凋亡的分子机制

欧诒丹 高元杰 陈静 (儋州市人民医院神经内科，海南 儋州 571700)

帕金森病(PD)在60岁以上人群发病率约1%〔1〕，是以运动迟缓、僵硬、姿势不稳和震颤为特征的神经退行性疾病〔2〕。建立PD模型细胞可研究PD发展的分子机制，为其治疗提供分子靶点。

研究表明，miRNA参与PD相关基因的表达调控，长链非编码RNA(LncRNA)参与PD的发病过程，miRNA和lncRNA可能是PD的潜在治疗靶点〔3〕。生长抑制特异性转录本(GAS)5在癌症中广泛存在，可抑制多种肿瘤的发生发展〔4〕。但目前GAS5对PD的影响还不清楚，需要进一步研究。本研究通过生物信息学预测发现，miR-128可能是GAS5的靶基因。研究发现miR-128在PD中起重要的作用，敲低miR-128表达小鼠可出现运动障碍表现〔5〕。本研究通过以1-甲基-4-苯基吡啶阳离子(MPP+)处理SK-N-SH细胞24 h的方式建立PD细胞模型，检测GAS5和miR-128对PD模型细胞活性和凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1材料 人神经母细胞瘤细胞SK-N-SH购自ATCC；DMEM高糖培养基和胎牛血清(FBS)购自美国Gibco公司，MPP+、胰蛋白酶、四甲基偶氮唑盐(MTT)和二甲基亚砜(DMSO)购自美国Sigma-Aldrich公司；B淋巴细胞瘤(Bcl-2)抗体、Bcl-2相关X蛋白(Bax)抗体和抗GAPDH抗体购自上海碧云天生物科技有限公司；Real-time PCR 试剂盒、反转录(RT)-PCR试剂盒购自宝生物工程(大连)有限公司；总RNA提取试剂TRIzol和Lipofectamine2000转染试剂购自美国Invitrogen公司；流式法细胞凋亡检测试剂盒购自美国BD公司；引物、GAS5过表达载体(pcDNA3.1-GAS5)、GAS5干扰物(si-GAS5)、miR-128模拟物(miR-128)、miR-128抑制剂(anti-miR-128)、阴性对照(miR-NC、si-NC、anti-miR-NC和pcDNA)、GAS5的野生型和突变型双荧光素酶载体购自上海吉玛基因；流式细胞仪购自美国BD公司，光学显微镜、全自动酶标仪、发光仪及Real-time PCR仪购自美国Bio-rad公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养 将SK-N-SH细胞培养在含10% FBS、100 U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素的DMEM高糖培养基中，置于5% CO2、37℃培养箱中常规培养。待细胞生长融合成单层时，用胰蛋白酶消化传代。

1.2.2PD细胞模型建立〔6〕取对数生长期的SK-N-SH细胞进行模型建立。分为对照(Con)组：SK-N-SH细胞正常培养；MPP+组：培养液中加入终浓度为2.50 mmol/L的MPP+，继续培养24 h。MPP++转染组：加入终浓度为2.50 mmol/L的MPP+培养24 h后进行细胞转染。

1.2.3细胞转染 将加入MPP+后培养24 h的SK-N-SH细胞，稀释为1×106个细胞/ml，以每孔200 μl(2×105个/孔)接种于6孔板中，待细胞生长融合成单层时按照Lipofectamine2000说明书进行转染。转染分组：GAS5抑制组(转染si-NC和si-GAS5)，miR-128过表达组(转染miR-NC和miR-128)，GAS5过表达组(转染pcDNA3.1和pcDNA3.1-GAS5)，GAS5和miR-128共抑制组(转染si-GAS5+anti-miR-NC和si-GAS5+anti-miR-128)，GAS5野生型和突变型双荧光素酶报告系统(转染miR-NC+WT-GAS5、miR-128+WT-GAS5、miR-NC+MUT-GAS5和miR-128+MUT-GAS5)，将各载体或片段转入MPP+处理24 h的SK-N-SH细胞中，转染48 h，收集细胞，进行后续实验。

1.2.4Real-time PCR检测RNA的表达 收集MPP+处理和(或)转染后的各组SK-N-SH细胞，用TRIzol试剂提取细胞总RNA，然后按照反转录试剂盒说明书反转录合成cDNA，以cDNA为模板按照 Real-time PCR的说明书进行反应合成miR-128 和GAS5，反应程序为：94℃ 5 min；94℃ 30 s、60℃ 30 s、72℃ 45 s，40个循环；72℃ 5 min。用2-ΔΔCt方法进行数据分析。

1.2.5MTT法检测细胞活性 收集MPP+处理和(或)转染后的各组细胞，稀释后以2×103个细胞/孔接种于96孔板，在培养至24 h、48 h和72 h时进行MTT实验，酶标仪检测每孔细胞的OD490 nm(A)值。

1.2.6流式细胞术测定细胞凋亡率 收集MPP+处理和(或)转染后的各组细胞，以每孔2×104个细胞接种于6孔板中培养48 h，弃去培养液，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤2次，按照流式法细胞凋亡检测试剂盒说明书进行操作，上流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.2.7Western印迹检测蛋白表达 收集MPP+处理和(或)转染后的各组细胞，冰浴超声破碎细胞，离心收集蛋白，将蛋白样本进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS-PAGE)分离，然后将蛋白条带转聚偏氟乙烯(PVDF)膜，室温封闭2 h，加入稀释的一抗(Bcl-2抗体1∶2 000、Bax抗体1∶1 000和GAPDH抗体1∶3 000)，4℃过夜孵育，PBST洗膜2次，加入稀释的酶标二抗，室温孵育1 h，显影，以GAPDH 为内参照，分析蛋白表达水平。

1.3统计学处理 采用SPSS19.0软件进行方差分析、t检验。

2 结 果

2.1MPP+处理对SK-N-SH细胞的影响 与Con组相比，MPP+组处理的SK-N-SH细胞凋亡率显著升高，细胞中Bax表达显著升高，Bcl-2表达显著降低，细胞在24 h、48 h和72 h的OD值均显著降低(均P<0.001)，见图1、表1、图2。

图1 MPP+处理对SK-N-SH细胞凋亡的影响

表1 MPP+处理对SK-N-SH细胞的影响

图2 MPP+处理对SK-N-SH细胞凋亡蛋白表达的影响

2.2GAS5、miR-128在MPP+处理的SK-N-SH细胞中的表达 与Con组相比，MPP+组处理的SK-N-SH细胞中GAS5含量显著升高，miR-128含量显著下降(均P<0.001)，见表2。

2.3抑制GAS5对细胞MPP+处理的SK-N-SH细胞活性及凋亡的影响 与MPP++si-NC组相比，MPP++si-GAS5组SK-N-SH细胞中GAS5和Bax表达显著下降，Bcl-2表达显著升高，细胞凋亡率显著下降，细胞OD值在24 h、48 h和72 h均显著升高(均P<0.001)，见表3、图3、图4。

表2 GAS5、miR-128在MPP+处理的SK-N-SH细胞中的表达

表3 抑制GAS5对细胞MPP+处理的SK-N-SH细胞活性及凋亡的影响

图3 抑制GAS5对细胞MPP+处理的SK-N-SH 凋亡的影响

1，2：MMP+-si-NC组,MMP+-si-GAS5组图4 抑制GAS5对细胞MPP+处理的SK-N-SH 凋亡蛋白表达的影响

2.4GAS5靶向调控miR-128的表达 miR-128的中含有与GAS5互补的序列，见图5。与miR-NC组相比，过表达miR-128组野生型WT-GAS5的萤火虫荧光素酶相对活性显著降低(P<0.05)；而突变型MUT-GAS5的荧光素酶相对活性无显著变化。见表4。qRT-PCR结果表明，与pcDNA3.1组(1.01±0.10)相比，过表达GAS5可使miR-128含量显著下调(0.31±0.03，P<0.05)；与si-NC组(1.03±0.10)相比，抑制GAS5表达可上调miR-128含量(1.62±0.16，P<0.05)。

图5 GAS5靶向miR-128

2.5过表达miR-128对MPP+处理的SK-N-SH细胞活性及凋亡的影响 与MPP++miR-NC组相比，MPP++miR-128组SK-N-SH细胞中miR-128和Bcl-2含量显著升高，Bax表达显著降低(P<0.05)，细胞凋亡率显著降低，细胞OD值在24 h、48 h和72 h均显著升高(均P<0.001)，见图6、图7、表5。

表4 双荧光素酶报告实验

图6 过表达miR-128对MPP+处理的SK-N-SH凋亡的影响

1，2：MMP+-miR-NC组，MMP++miR-128组图7 过表达miR-128对MPP+处理的SK-N-SH凋亡蛋白表达的影响

2.6抑制miR-128能逆转抑制GAS5对细胞MPP+处理的SK-N-SH细胞活性及凋亡的作用 与MPP++si-GAS5+anti-miR-NC组相比，MPP++si-GAS5+anti-miR-128组SK-N-SH细胞中GAS5和Bax蛋白表达显著升高(均P<0.001)，miR-128和Bcl-2蛋白表达显著降低，细胞凋亡率显著升高，细胞OD值在24 h、48 h和72 h均显著降低(均P<0.001)，见表6、图8、图9。

表5 过表达miR-128对MPP+处理的SK-N-SH细胞活性及凋亡的影响

表6 抑制miR-128能逆转抑制GAS5对细胞MPP+处理的SK-N-SH细胞活性及凋亡的影响

图8 抑制miR-128能逆转抑制GAS5对细胞MPP+处理的SK-N-SH凋亡的影响

1，2：MPP++si-GAS5+anti-miR-NC组,MPP++si-GAS5+anti-miR-128组图9 抑制miR-128能逆转抑制GAS5对细胞MPP+处理的SK-N-SH凋亡蛋白表达的影响

3 讨 论

PD影响着0.1%～0.2%的人类，是一种多因素导致的神经退行性疾病，导致运动功能减退，影响患者正常生活，且大多在神经元完全退化后期才被发现，缺乏早期诊断技术和后期治疗策略，发现其早期诊断标志物和后期治疗靶点是疾病研究的热点〔7〕。

越来越多的研究表明，lncRNA参与中枢神经系统基因表达调控不同的分子机制，调控从染色质重塑为主的神经干细胞分化到神经元活动，通过驱动不同的调控机制触发退行性神经死亡和病变〔7〕。LncRNA GAS5是GAS5，其通过调控细胞增殖、凋亡、细胞周期等生命过程，与心肌梗死、脑卒中、高血压等多种疾病的发生、发展及治疗密切相关〔8〕，其在癌症中多异常表达，过表达GAS5可抑制多种肿瘤的发生发展〔9〕。但GAS5在神经系统疾病中的研究较少。最新研究表明，在大鼠嗜铬细胞瘤(PC12)细胞中，高表达GAS5能促进PC12细胞向Tuj1阳性神经元样细胞分化，显著抑制PC12细胞增殖和细胞周期，不影响PC12细胞的凋亡，提高胆碱乙酰转移酶的表达，促进胆碱的释放，GAS5可能有利于神经元和胆碱能神经系统的恢复〔10〕。GAS5在PD中的表达尚不清楚。本研究发现，GAS5在MPP+处理的SK-N-SH细胞(PD模型)中含量显著升高，MPP+可促进SK-N-SH细胞凋亡并抑制细胞活性，抑制GAS5可提高MPP+处理的SK-N-SH细胞活性并抑制细胞凋亡。说明，GAS可能在PD的发展过程中发挥重要作用。

本研究通过TargetScan预测发现，miR-128 中含有与GAS5互补的序列，miR-128可能是GAS5的靶基因。miR-128在成年神经元中通过调节神经元信号网络和兴奋性来调节运动行为。在小鼠中，出生后神经元miR-128表达的减少可导致运动活动增加和致命的癫痫，miR-128的过度表达减弱了神经元的反应性，抑制了小鼠的运动活动，减轻了与PD和癫痫发作相关的运动异常〔11〕。在PD小鼠中，miR-128表达降低，其靶向负调控轴抑制蛋白(AXIN)1，高表达miR-128可抑制多巴胺神经元的凋亡并促进兴奋性氨基酸转运体(EAAT)4的表达〔12〕。本研究发现，miR-128在MPP+处理的SK-N-SH细胞(PD模型)中含量显著下降，高表达miR-128可提高MPP+处理的SK-N-SH细胞活性并抑制细胞凋亡，与上述结论〔12〕类似。双荧光素酶报告系统和qRT-PCR结果表明，GAS5靶向负调控miR-128的表达，抑制miR-128逆转了抑制GAS5对MPP+处理的SK-N-SH细胞活性和凋亡的影响，验证了最初的预测，在PD模型细胞中GAS5与miR-128之间具有调控关系。

综上，在MPP+处理的PD模型细胞SK-N-SH中，lncRNA GAS5通过靶向miR-128调控PD模型细胞活性和凋亡，提示GAS5和miR-128是可能PD治疗的潜在分子靶点。