依帕列净调节糖尿病相关非编码RNA表达机制

上官同琴 (郑州市第九人民医院，河南 郑州 450000)

2型糖尿病(T2DM)约占所有糖尿病患者的90%，其胰岛素产生能力并未完全丧失但胰岛素受体却有明显减少。T2DM治疗除了胰岛素外主要还包括双胍类、噻唑烷二酮类、磺脲类、α糖苷酶抑制剂等药物，但这些药物均有增加体重同时提高心血管疾病的潜在风险〔1，2〕。转运蛋白在调节葡萄糖稳态中起重要作用，因为它们是葡萄糖通过细胞膜时的载体与通道。在哺乳动物中，有两类葡萄糖转运蛋白，它们属于溶质载体(SLC)基因序列，包含50多个转运蛋白家族。促进型葡萄糖扩散系统转运蛋白(GLUT1)-4和GLUT6-12由SLC2家族编码，而钠-葡萄糖协同转运蛋白(SGLT)1～5由SLC5家族编码。

SGLT2 负责过滤后的葡萄糖在肾脏中的大量重吸收。SGLT2抑制剂是一类新型T2DM降糖药物，其通过抑制肾脏对血糖重吸收来增加尿糖浓度〔3〕。依帕列净是这类抑制剂中最有效的一种药物，被广泛用于治疗T2DM〔4〕，其主要作用机制为通过抑制近端小管上的SGLT2蛋白来抑制肾脏对葡萄糖的重吸收，使得尿糖增加、血糖降低达到治疗糖尿病的目的〔5，7〕。之前的研究都较多集中于对依帕列净临床安全性、药理作用、药动学等方面的研究〔8，9〕，而分子机制尤其非编码RNA方向的研究则鲜有报道。本研究对依帕列净引起组织非编码RNA表达差异进行研究，初步阐述其导致差异表达的相关机制，为其研究提供了新的思路。

1 材料与方法

1.1材料 TRIZOL(Invitrogen，美国, 15596-026)，反转录试剂盒 (Thermo Fisher Scientific，美国, K1621)、荧光定量PCR 试剂盒 ( TAKARA，日本，RR014A), SGLT2 一 抗(abcam，美国，ab85626)、 NF-κB一抗(abcam，美国，ab16502)、GAPDH 一抗(abcam，美国，ab8245)、山羊抗兔二抗(abcam, 美国，ab6721)。

1.2方法

1.2.1小鼠给药 选取6周龄的T2DM STZ模型小鼠6只，分成对照组(3只)和依帕列净组(3只)。依帕列净组小鼠通过饮食给药法，按照每天300 mg/kg给与依帕列净治疗，连续给药12 w。对照组小鼠给予相同饮食，但不含依帕列净。按时对小鼠血糖和体重进行检测及记录，检测时剪去小鼠尾巴端部约1 mm，待有血滴渗出后滴加于血糖检测仪器上，同时记录。

1.2.2Western印迹检测 Western印迹检测两组SGLT2、NF-κB蛋白表达。将小鼠处死后分别取出肾脏及胰腺，加入800 μl RIPA 冰浴研磨裂解30 min，4℃温度下12 000 r/min离心30 min后去除沉淀。测定浓度后取30 μg加入4×上样缓冲液及RIPA配制20 μl体积，100℃煮沸5 min后冷却上样，进行聚丙酰胺凝胶电泳，80 V电泳120 min后湿法70 V转膜100 min。5%脱脂奶粉封闭1 h后，一抗孵育过夜，第2天PBST清洗后加入二抗室温孵育1 h后滴加显色液曝光。

1.2.3qRT-PCR 将小鼠处死后分别取出肾脏及胰腺，用1 ml TRIZOL研磨裂解后提冰上静置5 min，加入200 μl三氯甲烷，12 000 r/min 4℃离心15 min取上清加入等体积异丙醇，冰浴静置30 min后4℃温度下12 000 r/min离心30 min，用75%乙醇洗涤沉淀2次并用无RNA酶的水溶解。测定浓度后取500 ng总进行RT-PCR，并用所得cDNA经行Q-PCR并进行分析,内参为β-actin。miR-370的Q-PCR中，直接取用2 ng总RNA进行发转，后用miR-370特异探针进行Q-PCR检测，内参为U6。

1.2.4靶向SGLT2的mRNA序列 通过生物信息学软件预测分析(www.mirbase.org)可能靶向SGLT2(official symbol：SLC5A2)的mRNA序列及其结合区域。连续给药12 w的小鼠牺牲后，取肾脏提取总RNA。Q-RT-PCR检测靶向SGLT2 mRNA的miRNA及糖代谢相关LncRNA的表达量。

1.3统计学方法 采用SPSS16.0软件进行双尾t检验。

2 结 果

2.1依帕列净可抑制SGLT2表达并降低T2DM模型小鼠血糖水平 与对照组相比较，依帕列净组肾脏中SGLT2的蛋白及mRNA水平明显降低(P<0.05)。依帕列净组血糖含量明显低于对照组(P<0.01)。依帕列净组体重相比于对照组也有降低,但差异无统计学意义。见图1、表1、表2。

图1 Western印迹检测小鼠肾脏组织SGLT2表达

2.2依帕列净可促进靶向SGLT2的miRNA表达增加 miR-370可靶向结合SGLT2基因的3′UTR区域，其序列为UUGGUCCAAGGUGGGGUCGUCCG-5′，共有8mer的配对序列。依帕列净组肾脏中靶向SGLT2 mRNA的miR-370的表达量有明显高于对照组(P<0.05)。见图2、表1。

2.3依帕列净可影响胰腺中糖尿病相关LncRNA的表达 与对照组比较，依帕列净组Lnc-P12792、MALAT1的表达有下降，而KCNQOT1的表达量改变不明显。依帕列净组NF-κB(p65)较对照组显著下降。见图3、表1。

表1 两组相关指标比较

表2 两组不同时间体重及血糖比较

图2 生物信息学预测靶向SGLT2的miRNA及靶向位点

图3 Western检测小鼠肾脏中LncRNA相关转录因子表达水平

3 讨 论

T2DM及其心血管、肾脏并发症的发生率呈上升趋势。因此，除了生活方式的干预外，针对T2DM及其微血管和大血管并发症的预防及治疗，患者还需要使用不同种类的药物。在抗糖尿病药物中，二甲双胍被认为是治疗T2DM的初始药物，但许多患者需要添加第二种药物。SGLT2抑制剂的使用已被证实与许多T2DM患者的代谢和心血管益处相关，其处方率有望大幅增加。

依帕列净是近年来应用于治疗而型糖尿病的新型药物，其对血糖及体重的控制有较明显的作用。为了验证抑制作用的可靠性，本研究结果显示，依帕列净有效抑制SGLT2的转录及蛋白水平，表明本研究给药方法切实可行且与之前试验研究一致〔10，11〕，对小鼠血糖含量检测结果也显示，给药组小鼠的血糖含量降低到正常水平(100 mg/dl)。同时对小鼠体重监测结果显示，依帕列净可在降低血糖同时降低体重，这一结果与之前报道一致〔12〕。

随后对依帕列净抑制SGLT2表达的作用机制进行了研究。通过生物信息学软件进行分析发现，只有miR-370靶向作用与SGLT2的mRNA，其特异性的结合于3′UTR区域，介导SGLT2 mRNA的降解抑制其表达。本研究结果提示依帕列净作用机制之一可能通过促进miR-370的表达使得SGLT2的mRNA大量降解，从而抑制SGLT2蛋白的表达量。为了更进一步分析依帕列净对糖尿病相关非编码RNA的影响，本研究对给药小鼠胰腺进行分离并提取了RNA及蛋白。Lnc-P12792、MALAT1两种LncRNA的表达量有降低，而在之前的研究中发现在T2DM的胰岛B细胞中这两种LncRNA的表达量均有升高表达〔13，14〕。这一结果提示依帕列净在抑制肾脏对血糖重吸收的同时也在分子水平上改善着胰岛β细胞的功能。为了更进一步探究其调控的分子机制，本研究对肾脏组织蛋白样品进行Western印迹检测，实验结果显示其转录因子NF-κB(p65)的表达量有降低趋势。该实验结果证明，依帕列净可能通过抑制转录因子NF-κB(p65)的表达从而降低Lnc-P12792、MALAT1两种LncRNA的表达量。

综上所述，依帕列净抑制SGLT2的分子机制可能是通过促进miR-370的表达从而介导SGLT2 mRNA的降解并抑制其蛋白的表达，这一结果降低肾脏对血糖重吸收效率导致尿糖含量增加。同时依帕列净在降低血糖的同时也通过调节LncRNA的表达改善着胰岛细胞的功能，这一结果可能是长期正常血糖含量所引起的，同时也有可能是依帕列净存在其他调节机制，这需要进一步实验进行验证。本研究为依帕列净治疗糖尿病的机制提供了新的依据与分析角度，也为评估其可能存在风险的分析提供新视野，即依帕列净会引起转录因子及非编码RNA的表达改变则会对机体造成其他影响。