Toll样受体7/8与肾脏疾病

徐孝东 综述 刘志红 审校

肾脏是人类系统性自身免疫性疾病最常受累的器官,组织驻留免疫细胞是对局部损伤做出反应的理想场所。固有免疫是启动机体免疫应答的先头部队,可对自身或外源性抗原做出快速而强有力地回应,加强固有免疫细胞对外源信号分子的响应、分子调控网络中关键节点分子和核心功能分子的发现对于理解肾脏器官区域免疫激活和疾病的发生机制都具有重要意义[1]。Toll 样受体(TLR)是固有免疫系统中一类重要的表面模式识别受体,通过识别损伤相关模式分子(PAMPs)触发分子级联事件来诱导促炎因子的合成和分泌,进而激活固有免疫以清除病原体;而在无菌性炎症中,TLR的持续活化又增加了自身免疫性疾病发生的危险。作为特异性单链核酸感受器,TLR7/8在肾脏固有细胞和免疫细胞中广泛表达,是触发肾脏器官区域免疫调控网络中的关键节点分子,其异常激活可导致多种肾脏疾病[2]。本文就TLR7/8与肾脏疾病的关系做一综述,以进一步揭示TLR7/8在肾脏器官区域免疫中的特性和相关机制。

TLR7/8信号通路及激活方式

至今已发现11种人源性TLR和13种鼠源性TLR[3]。与TLR家族其他成员不同,TLR7/8分布于内体和溶酶体膜中,配体为单链RNA(ssRNA)。在蛋白结构方面,TLR7/8均属Ⅰ型跨膜糖蛋白,由胞外区、跨膜区和胞内信号转导区组成。胞外区由富含亮氨酸的串联重复序列组成,其作用是识别PAMPs;胞内区为核心区域,含有Toll和白细胞介素(IL)受体同源的结构域(TIR)信号区,负责激活下游信号级联反应。当TLR7/8与配体结合后,通过髓样分化因子88(MyD88)依次激活IL-1受体相关激酶、肿瘤坏死因子(TNF)受体相关因子6,最终通过核因子κB(NF-κB)、丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)和干扰素调节因子5(IRF5)三条信号途径合成和分泌促炎因子(IL-6,TNF-α等)。促炎因子一方面可以诱导组织细胞损伤,另一方面又可吸引和募集更多的炎症细胞到达炎症部位,加重组织损伤程度;在无菌性炎症中,TLR7/8的持续活化也可导致自身免疫性疾病[4]。虽然TLR7/8识别配体均为ssRNA,但激活方式有很大不同。

TLR7激活方式作为核酸感受器,TLR7的激活受到严格控制。生理情况下,TLR7以无活性的单体形式存在,与配体结合后引发单体二聚化,这是其激活的必要条件。TLR7为双重核酸感受器,具备两个配体结合位点。第一结合位点(1st)位于二聚体界面中心位置,配体为鸟苷(G);第二结合位点(2nd)靠近二聚体界面,配体为富含尿苷(U)的ssRNA(≥3-mer)。正常情况下,TLR7单体1st对G亲和力较低,无法引起TLR7单体二聚化;但当富含U的ssRNA片段与2nd结合后会使1st对G的亲和力提高。所以,存在ssRNA时,G一旦与TLR7的1st结合,会使TLR7构象发生改变,诱导单体二聚化,产生典型的“M”马蹄样结构。最后TLR7通过二聚体的TIR结构域之间的细胞内相互作用诱导信号级联反应。TLR7所识别的为ssRNA降解产物,而并非完整的ssRNA序列(图1)[5]。

图1 TLR7激活机制[7]TLR7:Toll样受休7;G:鸟苷；U：尿苷

除ssRNA外,TLR7也可被小分子化合物(如咪唑喹啉类)和G衍生物激活。小分子化合物与TLR7的亲和力远高于G,原因归因于小分子化合物比G增加了烷基基团,它可以插入到受体的疏水口袋内,增强与TLR7的1st亲和力。例如,TLR7对G和雷西莫特(R848)的亲和力(Kd)分别为 13.5 μM和0.49 μM,与R848的亲和力约为G的27.6倍,在高度亲和力的作用下即使缺乏ssRNA也可直接诱导TLR7单体发生二聚化和激活。但TLR7对G的亲和力可以通过ssRNA的结合显著增加,比如TLR7与ssRNA结合后其1st对G的Kd从13.5 μM提高到0.93 μM,亲和力提高了14.5倍[5]。这也就是说明,1st是所有类型配体激活TLR7所必需的,而2nd仅是ssRNA诱导激活所必需的。

通过TLR7对ssRNA序列识别偏好性分析发现,UUU基序为TLR7 2nd识别的最小核酸序列,位于中间的U2与TLR7 2nd的氨基酸残基之间形成氢键被严格识别,不能被其他核苷替换,而侧翼的U1和U3被松散识别,允许被其他核苷替换。此外,研究发现携带三个U-ssRNA激活TLR7的能力最强,携带两个U-ssRNA又比携带一个U-ssRNA展现出较强的TLR7激活能力,但值得注意的是,一些携带一个U-ssRNA序列仍然会展现出一定程度的TLR7激活能力。比如含有CUC基序ssRNA比含有GUG/AUA基序的ssRNA具备更强的TLR7激活能力。综合晶体学、生物物理学和细胞实验数据建立的TLR7-ssRNA序列偏好性的模型认为:TLR7 2nd的所识别第一个核苷优选U,其次为 C/A/G;第二个位置严选U;第三个位置优选U和C,其次为A和G;也就是说ssRNA 基序与TLR7亲和力大小依次为:UU (U/C)(高强度结合)>UU (G/A)(中度结合)>XUX (减弱或无结合;X代表A、G或C)[6]。

TLR8激活方式尽管TLR8与TLR7结构及识别配体相似,但激活机制有所区别。生理情况下,TLR8以二聚体形式存在,在没有配体结合前TLR8二聚体胞内段TIR信号域距离较远,没有生物活性;当TLR8二聚体与配体协同激活后,二聚体胞内段TIR信号区域相互靠近,进而募集下游MyD88接头蛋白触发级联反应[7]。TLR8在人类和小鼠中的作用存在重要差异,比如人类TLR8可通过识别ssRNA介导宿主天然免疫,但小鼠TLR8对ssRNA刺激不敏感。原因在于啮齿类动物TLR8缺乏识别配体过程中起着重要作用的5个保守氨基酸基序(RQSYA)[8]。本文主要就人类TLR8进行阐述。

TLR8也具备两个配体结合位点,为双配体协同激活[7]。1st位于二聚化界面的中心,配体为ssRNA降解产物U;2nd位于二聚体的凹面上,配体为含RU基序(R为嘌呤,代表G或A)的ssRNA。生理情况下,TLR8 1st对U亲和力较弱,在缺乏RU-ssRNA片段的情况下无法与1st结合;但当RU-ssRNA片段与TLR8 2nd结合后则会显著提高1st对U的亲和力,当TLR8被双位点协同激活后,胞内段TIR信号域发生构象变化而相互靠近,从而触发下游信号级联反应。比如,Li等[9]报道ssRNA120 (GUCUGAGUGUGUUCUUG)可激活TLR8并诱导TNF-α的释放,而将U 替代为A的fake RNA120 (GACAGAGAGAGAACAAG)则失去了对TLR8激活的能力(图2)。

图2 TLR8的激活机制[11]TLR8:Toll样受休8;U：尿苷

尽管TLR8 1st表现出对U的偏好性,但TLR8对U的亲和力(Kd=55 μM)仍然低于小分子化合物(如R848的Kd=0.20 μM)。在ssRNA存在的情况下,TLR8对U的Kd值可以增加达到1.0 μM,这意味着在生理条件下,U不能单独激活TLR8,但ssRNA的存在弥补了U相对较低的亲和力的缺点;而小分子化合物本身与TLR8 1st的亲和力足够高,所以在缺乏ssRNA的情况下仍可以激活TLR8。这些结果表明,若ssRNA激活TLR8则必须结合2两个识别位点,而小分子化合物仅需要与1st结合即可[7]。

既然TLR8通过两个不同的结合位点来感知RNA降解产物,这表明不同ssRNA对TLR8的刺激可能涉及到一种共同的RNA降解途径。研究表明,核糖核酸内切酶(RNase T2)是TLR8识别RNA分子的关键上游成分,它在有核细胞中广泛表达。由于RNase T2对ssRNA中的RU基序具有独特的底物特异性,RNase T2优先在R-U之间裂解ssRNA分子,产生R-2’,3’-环磷酸末端片段,这些寡核苷酸构成了TLR8 2nd的理想配体;此外,RNase T2也会增加对U-磷酸(U>p)的分解代谢,这是激活TLR8的另一个先决条件[10]。TLR8 2nd能容纳R端残基的二核苷酸和三核苷酸,而R之前的核苷酸优选U,其次为R(例如(U)UR>p)。通过对TLR8 2nd所识别的ssRNA 基序长度发现,(U)URU构成了ssRNA激活TLR8的最短基序[10]。但另一项研究认为,RNase T2除了可以在R-U残基之间裂解,也可以在嘧啶(Y,代表C或U)-U之间裂解,剪切位点发生在U之前。另一种核酸酶RNase 2与RNase T2协同互补,裂解作用位点发生在U之后,在两种核酸酶的作用下导致ssRNA 协同释放U和ssRNA短链[11]。

TLR7/8与肾脏疾病

TLR7与肾脏疾病Tlr7基因位于X染色体,主要在B细胞和浆细胞样树突状细胞(pDC)中表达,所以女性中的表达量要高于男性,而暴露于TLR7激动剂的女性B细胞比来自男性的B细胞会更有效地分化为抗体分泌细胞[12];这也是女性系统性红斑狼疮(SLE)患病率要高于男性的主要因素之一[13]。

TLR7与自身免疫性疾病中的关系已在SLE小鼠模型中得到充分阐述。比如自身抗原可在B细胞表面被B细胞抗原受体(BCR)识别,从而启动其细胞内化过程,一旦进入内体,自身抗原可激活B细胞中的TLR7,使B细胞优先被招募到生发中心并分化为CD138+浆母细胞,增加个体对SLE的易感性[14]。在MRL/lpr小鼠模型中,适度增加Tlr7基因拷贝量可促进具有RNA特异性的自身反应性淋巴细胞和髓系细胞的增殖,产生以抗U1小核糖核蛋白抗体(抗RNP抗体)积累为特征的狼疮样综合征[15];大量增加Tlr7基因拷贝量则可发生致死性炎症反应,而敲除Tlr7基因可缓解疾病进展和病情严重程度,并减少针对自身RNA抗原的抗体水平,抑制淋巴细胞的激活和血清IgG含量[16-17],但不会降低抗双链DNA(ds-DNA)抗体的水平,因为ds-DNA抗体的产生取决于TLR9的表达[18]。本研究团队近期的一项临床研究表明,由霉酚酸酯、他克莫司和类固醇组成的多靶点疗法比单药常规治疗更能有效地实现重症狼疮性肾炎(LN)患者的完全缓解。为了探索多靶点疗法的潜在分子机制,本研究团队采用单一疗法或多靶点疗法对MRL/lpr小鼠进行治疗,研究发现与单一疗法相比,多靶点疗法能显著改善肾脏预后,通过转录组学分析显示,多靶点疗法能显著抑制小鼠肾脏中的TLR7表达和下游IL-6/Stat3通路激活。随后该结论在LN患者的肾活检组织样本中进一步得到验证[19]。此外,TLR7同样在糖尿病中扮演着非常重要的调控作用,比如与野生型非肥胖糖尿病(NOD)小鼠相比,Tlr7-/-NOD小鼠的发病时间明显延迟,1型糖尿病的发病率也显著降低;分子机制研究表明Tlr7基因敲除促进了B细胞PD-L1的表达,以此来抑制CD4+T细胞的增殖;并通过下调B细胞主要组织相容性复合体(MHC)分子的表达减弱其抗原呈递功能,抑制细胞毒性CD8+T细胞的增殖与激活。因此,靶向TLR7的治疗可能有助于糖尿病的预防[20]。Zheng等[21]研究发现,IgA肾病患者肾组织中浸润的B细胞表达TLR7水平与肾功能[估算的肾小球滤过率(eGFR)和血清肌酐]及肾组织病理学指标(肾小管萎缩、白细胞浸润、肾小管间质纤维化和肾小球硬化)密切相关;浸润的TLR7+CD19+B细胞不仅在肾脏中上调炎症因子分泌水平,而且还可通过TLR7-GALT2轴促进半乳糖缺乏型IgA1的合成,加重IgA肾病患者炎症程度和促进疾病进程。

微小RNA(miRNA)作为ssRNA的一种特殊形式,除了在转录后基因调控中的常规作用,还可以直接作为TLR7的生理配体。最近的研究表明,具有富含UG序列的成熟miRNAs也能激活TLR7。例如,miR-21、miR-29a、miR-25-3p和miR-92a-3p均富含UG序列,可以作为小鼠TLR7配体诱导巨噬细胞分泌促炎因子[22-23]。Lehmann等[24]发现富含UG序列miRNA let-7b在神经元中作为TLR7信号的有效激活因子,诱导神经变性。Wang等[25]发现肝细胞受损后会以被动形式向循环中释放大量的miR-122,miR-122被小鼠肺泡巨噬细胞吸收并作为配体激活TLR7,导致巨噬细胞M1极化和分泌大量炎性细胞因子(如TNF-α和IL-6)。通过组织病理学分析发现肝损伤小鼠模型的肾脏也出现不同程度损伤,但是否由miR-122通过循环系统激活肾组织固有细胞或巨噬细胞TLR7而引起肾脏炎症和组织损伤有待进一步研究。

TLR8与肾脏疾病与TLR7不同,TLR8在pDCs和B细胞中不表达,而在髓系细胞中大量表达,如单核细胞,巨噬细胞和中性粒细胞。因鼠源TLR8不识别ssRNA,为研究人源TLR8的分子机制,Guiducci等[26]建立了多株表达不同人源Tlr8(hTlr8)基因拷贝量的转基因小鼠,研究发现,表达高拷贝量hTlr8的小鼠逐渐发展为消瘦性疾病,其胰腺、肾脏、唾液腺和关节部分出现严重炎症,肾组织病变类型主要为肾盂肾炎和肾小球肾炎,其疾病严重程度与hTlr8表达水平密切相关。随后作者在细胞水平上证实hTlr8是通过上调树突状细胞共刺激分子的表达以增强了对T细胞的激活作用。重要的是,虽然TLR7和TLR8在小鼠中的过度表达都会导致致死性炎症反应,但疾病表型却截然不同, Tlr7转基因小鼠发生肾小球肾炎、肝坏死和严重的贫血,但胰腺、关节和唾液腺不受影响,这使得肾小球肾炎成为两种模型之间唯一的共同特征。另外在Tlr7转基因小鼠中,剔除B细胞足以消除疾病症状,这表明在该模型中B细胞Tlr7的过度表达驱动了疾病发展。而在hTlr8转基因小鼠中,B细胞表达非常低水平的hTLR8,并且不会扩张或浸润受累器官,所以B细胞不太可能扮演类似的中心角色。而单核细胞和巨噬细胞中的hTLR8激活及所分泌的细胞因子(IL12p70)可以诱导下游Th1细胞反应,促进IL-18和IL-12p70的释放,进而触发NK细胞释放IFN-g[27]。所以推测hTlr8转基因小鼠疾病发展的原因更有可能是DCs和巨噬细胞激活产生促炎因子以及促进Th1启动和分化导致的器官损伤所致[26]。

尽管鼠类TLR8(mTLR8)不能对ssRNA产生免疫反应,但有研究显示,在狼疮小鼠的肾组织中mTLR8 mRNA表达量及下游促炎因子水平要显著高于正常对照组,而且其mRNA水平与足细胞功能标志物(Nphs1、Nphs2和Synpo)水平呈显著负相关,与尿白蛋白量呈正相关,研究结果提示mTlr8的过表达与足细胞损伤及疾病进展相关,但狼疮小鼠mTLR8是如何激活的尚不清楚[28]。另一项研究指出,小鼠单侧梗阻致使肾小球和血清miR-21水平升高。miR-21可通过激活足细胞TLR8信号通路并分泌炎性因子进而导致足细胞损伤[29]。但此项研究尚缺乏miR-21激活足细胞TLR8的直接分子生物学实验。

小结：肾脏作为机体一个功能复杂的重要器官,具备独特的区域免疫学特性,对其分子调控网络中关键节点分子和核心功能分子的发现和认识对于理解组织器官区域免疫在特定疾病发生机制中的作用具有重要意义。进一步阐明TLR7/8作为触发区域免疫的关键因子在肾脏疾病的发生发展中的作用,将有助于提升对肾组织器官的区域免疫学特性的了解和促进新免疫治疗靶点的发现。