自噬对激素性股骨头坏死大鼠模型血脂及血液流变学的影响

刘树义，兰 凯，张旭东，李 瑜

（1.西安医学院临床医学院外科学教研室，陕西 西安 710021；2.西安医学院第二附属医院耳鼻咽喉科，陕西 西安 710038）

激素性股骨头坏死（steroid-induced avascular necrosis of the femoral head，SANFH）是非创伤性股骨头坏死中最常见的类型，约占51%，其发病与激素过量或长期使用密切相关[1]。近年来，随着激素的广泛应用，其发病率呈逐年增加趋势，且以男性青壮年居多。研究显示[2]，口服泼尼松的剂量每日提高10 mg，股骨头坏死的发病率就会提高4.6 倍。由于SANFH 通常累及双侧髋关节，致残率较高，给患者家庭和国家造成巨大的经济损失和社会负担，已成为威胁社会及人类健康的难治性疾病。目前对SANFH 的治疗仅局限于手术治疗，近70%的患者通过实施人工髋关节置换术能有效改善患者的生活质量，总体疗效显著[3]；但由于人工关节材料有一定的使用寿命，且关节置换术后存在假体周围骨折、感染、假体松动等并发症，使手术治疗存在着局限性[4]。因此，研究SANFH 的发病机制及寻找更加有效的非手术治疗方法，是目前亟待解决的临床问题。研究表明[5]，激素是诱导自噬的重要因素，自噬活性增强的结果是细胞发生过度死亡。SANFH 作为大剂量激素使用的并发症之一，很可能与自噬存在密切关系。此外，部分研究结果显示，正常情况下，机体可通过“噬脂”现象来调节肝脏和脂肪组织中甘油三酯的代谢，即自噬性调节途径[6]，但在病理状态下，这种自噬性调节的方向是不明确的，甚至会造成脂质代谢紊乱[7，8]。韩晓蕊等[9]利用多模态MRI 技术分析SANFH 患者股骨头时发现，在坏死区脂肪含量明显高于非坏死区。基于此，推测SANFH 的发病与自噬、脂质代谢紊乱有密切联系，而导致股骨头出现坏死的途径很可能是：①自噬活性增强后，骨细胞出现过度自噬性死亡；②激素诱导自噬活性增强后，机体脂质代谢紊乱，造成股骨头内脂肪堆积、高压，继而骨细胞发生缺血坏死。为证实上述假设，本研究通过构建SANFH 大鼠模型，并诱发体内细胞自噬活性，进一步分析自噬对SANFH 大鼠脂质代谢的作用，为寻找更加有效的治疗途径提供思路与理论依据，现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物及材料 本研究实验动物SD 大鼠24只（清洁级）购自西安交通大学医学部实验动物中心[动物合格证：SCXK（陕）2018-001]，雌、雄各半，平均体重为（286.12±12.96）g。脂多糖（货号：L8880）、3-甲基腺嘌呤（3-MA，货号：IM0190）、雷帕霉素（Rapamycin，货号：R8140）购自北京索莱宝科技有限公司；注射用甲泼尼龙琥珀酸钠（40 mg/瓶）购自辉瑞制药有限公司；RIPA 裂解缓冲液（碧云天，P0013C）。

1.2 方法

1.2.1 分组及动物模型制备 大鼠进入动物中心后，适应性饲养1 周，采用随机数字表法分为4 组：对照组、模型组、自噬阻断组及自噬激动组，每组6 只，并采用大鼠耳标进行标记。将脂多糖溶于二甲基亚砜（DMSO）溶液中，浓度为0.01 μg/μl；甲强龙溶于生理盐水，浓度为40 mg/ml，分别将3-MA、雷帕霉素溶于DMSO 溶液，浓度均为1 mg/kg。模型组、自噬阻断组及自噬激动组大鼠称重后，按20 μg/kg 剂量先经腹腔注射脂多糖2 次，每次间隔24 h，对照组经腹腔给予20 μg/kg 生理盐水。脂多糖注射结束后，间隔24 h，按40 mg/kg 剂量，经两侧臀肌交替给予模型组、自噬阻断组及自噬激动组大鼠甲强龙注射，共3 次，每次间隔24 h；自噬阻断组、自噬激动组每次肌肉注射甲强龙前30 min，分别经腹腔注射3-MA（2.5 mg/kg）、雷帕霉素（1 mg/kg），对照组大鼠经臀肌、腹腔注射1 ml/kg 生理盐水。药物注射完成后继续饲养，并将大鼠将置于跑步机中，以1 km/h速度匀速跑动，30 min/次，2 次/周，跑动后正常笼中饲养，自由进食饮水。8 周后，经核磁共振（MRI）检查确认大鼠模型复制成功。模型制作结束后，采用10%水合氯醛进行腹腔麻醉，将大鼠固定于手术台上，常规消毒后用剪刀沿腹部中线打开腹腔，腹主动脉暴露清晰后保持入针角度约30°刺入采血针，连接真空采血管采集8～10 ml 血液，于4 ℃静置2 h后以3000 r/min 离心10 min，分离血清，-20 ℃保存。采血结束后，剪开双侧髋关节囊，剔除关节周围肌肉组织，充分暴露股骨头后，用刀片从冠状面劈开两半，其中一半置于10%中性甲醛溶液进行固定，另一半置于-80 ℃保存。

1.2.2 自噬活性评价方法 将上述股骨头组织称重后，加入液氮进行研磨，将骨质碎屑转移至1.5 ml 离心管中，按每20 mg 组织加入250 ml RIPA 裂解缓冲液，提取组织蛋白。BCA 法蛋白定量后采用Western blot 检测股骨头内LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表达水平。

1.2.3 血液流变学及血脂测定 经腹主动脉采血4 ml于抗凝管中，并在4 h 内采用全自动血液流变仪测定全血黏度、血浆黏度、红细胞压积及红细胞聚集指数等。采2 ml 血于促凝管中，离心制备血清，采用自动生化仪三联酶法检测血清总胆固醇（TCH）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白（HDL）和低密度脂蛋白（LDL）。

1.3 统计学方法 采用SPSS 21.0 软件进行统计学分析。计数资料采用[n（%）]表示，组间比较采用χ2检验或Fisher 确切概率法，计量资料采用（）表示，组间比较采用t检验或单因素方差分析。当P＜0.05时，认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 股骨头坏死情况分析 4 组SD 大鼠中，除对照组无股骨头无坏死外，模型组、自噬阻断组及自噬激动组股骨头坏死率分别为率分别为83.33%（5/6）、16.67%（1/6）、100.00%（6/6），组间比较，差异有统计学意义（χ2=17.110，P＜0.05）。

2.2 LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表达情况 4 组大鼠股骨头组织中，LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白均有不同程度表达，其中自噬阻断组低于对照组及模型组，自噬激动组LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表达高于对照组及模型组，差异均有统计学意义（P＜0.05），见图1、表1。

表1 四组SD 大鼠股骨头组织中LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白相对表达量比较（）

表1 四组SD 大鼠股骨头组织中LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白相对表达量比较（）

注：*与对照组比较，P＜0.05；#与模型组比较，P＜0.05；▲与自噬阻断组比较，P＜0.05；▼与模型组比较，P＜0.05

图1 4 组SD 大鼠股骨头组织Western blot 检测

2.3 各组血脂比较 应用激素后，模型组、自噬阻断组及自噬激动组TG、TCH、HDL 较对照组均有不同程度升高，差异有统计学意义（P＜0.05），而各组LDL比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见表2。

表2 各组大鼠血脂情况比较（，mmol/L）

表2 各组大鼠血脂情况比较（，mmol/L）

注：*与对照组比较，P＜0.05；#与模型组比较，P＜0.05；▲与自噬阻断组比较，P＜0.05；▼与模型组比较，P＜0.05

2.4 各组血液流变学指标比较 模型组、自噬阻断组及噬激动组全血粘度、血浆粘度、红细胞压积、红细胞聚集指数均高于对照组，差异有统计学意义（F=23.462，P＜0.05），见表3。

表3 四组大鼠血液流变学指标比较（）

表3 四组大鼠血液流变学指标比较（）

注：*与对照对照组比较，P＜0.05；#与模型组比较，P＜0.05；▲与自噬阻断组比较，P＜0.05；▼与模型组比较，P＜0.05

3 讨论

激素类药物已广泛应用于自身免疫性疾病、重症感染、SARS 等疾病的治疗，但随着激素使用剂量的增加和时间的延长，易造成多种并发症的出现，SANFH 是其中致残率较高的一种。目前对于SANFH 的发病机制尚不明确。但随着研究的深入，关于该病的发病机制形成了多种理论，包括血管内凝血[10]、骨髓间充质干细胞分化[11]、脂质代谢紊乱[12]、骨细胞凋亡[13]、骨质疏松[14]等理论。近年来越来越多的学者认为，细胞的死亡在一定程度上受到了基因的调控，即程序性细胞死亡，包括凋亡和自噬两种形式。在生理条件下，自噬可通过加快细胞代谢循环、协助细胞适应环境达成促进细胞存活的效果，但当机体细胞受到多种体内、外因素（如激素、缺氧、饥饿等）的作用时，其活性增强后可过度吞噬细胞内细胞器和细胞质，从而诱导细胞死亡[15]。此外，自噬也是机体自身脂肪代谢和干细胞成脂分化的重要调节途径，尤其是在肝细胞和脂肪细胞[16]。石少辉等[17]通过对63 例SANFH 患者的股骨头进行形态学观察发现，与创伤性股骨头坏死患者相比，SANFH 股骨头内脂肪面积、脂肪细胞密度、脂肪细胞直径均增加，而骨髓内造血面积明显减少，电镜结果提示骨髓内充满大小不等的脂滴。韩晓蕊等[18]应用MRIIDEALIQ 和IVIM-DWI 序列检查30 例SANFH 患者时发现，股骨头内脂肪分数和灌注分数均明显高于正常人。Motomura G 等[19]对4 例有早期股骨头坏死的尸体研究发现，早期激素性骨坏死患者脂肪细胞体积增大，而梁大伟等[20]对478 例股骨头坏死患者进行病因调查分析时发现，SANFH 患者血脂水平明显高于正常。由此可见，SANFH 的发病可能与脂质代谢紊乱有密切关系。然而，在SANFH 发病过程中，激素诱导自噬活性的增强是否对患者体内脂质代谢紊乱发挥了作用，仍有待进一步研究。

本研究通过构建SANFH 大鼠模型，并使用自噬调节剂进行干预，结果显示，大剂量使用甲强龙后，大鼠出现明显脂质代谢紊乱的现象，血液中TG、THC 及HDL 水平明显升高；当同时给予大鼠甲强龙和自噬阻断剂3-MA 时，LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表达明显下降，脂质代谢紊乱有所缓解，血液中TG、THC 及HDL 水平较模型组大鼠呈大幅度下降趋势，但仍高于对照组；当同时给予甲强龙和自噬激动剂雷帕霉素时，LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表达明显升高，脂质代谢紊乱也更加严重，血液中TG、THC 及HDL 水平大幅升高，且明显高于模型组和自噬阻断剂组（P＜0.05），这些结果均提示在激素的诱导下，自噬对SANFH 大鼠血脂有显著的调节作用，且自噬活性越高，血脂水平越高。此外，当对4 组大鼠血液进行流变学检测时，发现应用甲强龙后，大鼠血液全血粘度、血浆粘度、红细胞压积及红细胞聚集指数均出现明显改变，且高于正常水平。当同时应用自噬阻断剂3-MA 时，上述血液流变学指标均明显降低，但仍高于正常；当同时应用自噬激动剂雷帕霉素时，上述血液流变学指标显著升高（P＜0.05），这提示激素诱导下，自噬对血液流变学也具有调节作用，且自噬活性越强，血液粘度越大，高粘滞血症也严重。在药物干预结束后，所有大鼠经MRI 检查，结果发现对照组、模型组、自噬阻断剂组及自噬激动剂组大鼠股骨头坏死率分别为0、83.33%、16.67%及100.00%，这与各组大鼠脂代谢紊乱严重程度及血液流变学改变情况具有高度一致性。导致这种现象的主要原因在于①激素诱导的自噬活性增强，能够使体内血脂水平升高，进而使骨细胞出现脂肪变性、骨细胞核膜溶解；②激素诱导的自噬，同时也能使血液流变学发生显著改变，血液粘滞度增加，股骨头血液灌注量不足。微循环中血液通常是按照泊肃叶定律在流动，即毛细管中的流量与黏度成反比，当血液黏度升高时微循环灌注量将下降。此外，激素类药物能改变红细胞膜两侧的电化学梯度，使红细胞变形能力下降，红细胞之间的黏附力增加，最终会引起红细胞聚集效应[21]，而这种效应很可能也是自噬活性增强后调节血液流变学的结果。目前，许多研究表明[22，23]，SANFH 的发病与脂质代谢紊乱、高粘滞血症密切相关，通过调节血脂和改善血液动力学情况，能够在一定程度上预防和降低本病的发生率[24]，而且本研究也发现抑制自噬后能够大大降低股骨头坏死的发生率。

综上所述，在SANFH 大鼠中存在脂质代谢紊乱和高粘滞血症的现象，而这些现象的发生与体内自噬活性增强有密切关系。激素诱导的自噬能够使血液中血脂水平显著高于正常，血液流变学指标同样有明显改变，而自噬被抑制后，能大幅改善血脂和血液流变学情况，股骨头坏死率呈明显下降。这充分说明自噬对SANFH 血脂、血液流变学的调节有重要意义，在未来有望成为治疗SANFH 的重要途径之一。此外，本研究的不足之处在于未开展机制方面的研究，尚未找到干预的精准靶点，在今后的研究中将着力于此。