甲氧西林耐药表皮葡萄球菌的多重耐药表型分析及抗菌中药筛选

符冉冉，符方妹，黄寒梅，黄 聪，彭 玮，刘 鑫

（贵州中医药大学药学院药学专业1，基础医学院药理教研室2，基础医学院贵州中医药方证药理研究特色实验室3，贵州 贵阳 550000）

血流感染（bloodstream infection，BSI）是指细菌、真菌和毒素侵入血循环，在血液中繁殖、释放毒素和代谢产物，引起感染、中毒和全身炎症反应，进而引起全身多器官功能障碍综合征，是一种严重的全身感染性疾病。近些年，由于静脉置管、肠外给药、机械通气等侵入性操作及治疗的广泛开展，血流感染发生率呈逐年上升趋势，已成为住院患者最常见的死亡原因之一[1，2]。引起院内患者发生BSI 的重要菌群为革兰氏阳性球菌[3]；其中，凝固酶阴性葡萄球菌（CNS）分离率为50%以上[4-6]，甲氧西林耐药凝固酶阴性葡萄球菌（methicillin-resistance coagulase negative staphylococci，MRCNS）在BSI 中分离率高达88.4%以上[6]，并且MRCNS 菌株表现为多重耐药[7]。因此，MRCNS 的耐药性对临床治疗提出新的挑战。中医药用于治疗感染性疾病有着数千年历史，积累深厚，疗效卓越[8]。《本经》中记录“连翘主寒热，鼠痿，痈肿恶疮，瘰疬，结热，瘿瘤”。现代研究表明[9]，黄连、夏枯草、大黄、鱼腥草、金钱草对病原菌具有较突出的抗菌活性。此外，中药对于多重耐药菌也表现出较强的抗菌活性，提示中药对于MRSE 可能具有抗菌作用。基于此，本研究通过实验室体外诱导方法获得MRSE，同时对其进行临床常用抗菌药物的敏感性测定分析，进而选取53 种中药对MRSE 抗菌活性进行筛选，以此指导临床合理使用抗菌药物，以及筛选出对血流感染的控制具有重要意义中药材。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 菌株表皮葡萄球菌ATCC12228（购自中科院细胞库）。

1.1.2 抗菌药物 均购自北京索莱宝生物科技有限公司，具体如下：甲氧西林钠（Methicillin sodium salt；CAS:132-92-3）、青霉素G 钠盐（Penicillin G Sodium salt；CAS：69-57-8）、盐酸四环素（Tetracyclin HCl；CAS:64-75-5）、硫酸庆大霉素（Gentamycin Sulfate；CAS:1405-41-0）、盐酸万古霉素（Vancomycin；CAS:1404-93-9）、苯唑西林钠（Oxacillin sodium；CAS:1173-88-2）、盐酸克林霉素（Clindamycin hydrochloride；CAS:21462-39-5）、利奈唑胺（Linezolid；CAS:165800-03-0）；利福平（Rifampicin；CAS:13292-46-1）、替加环素（Tigecycline；CAS:220620-09-7）、左氧氟沙星（Levofloxacin；CAS:138199-71-0）、头孢西丁（Cefoxitin；CAS:35607-66-0）、氨苄青霉素（Ampicillin；CAS:69-53-4）、红霉素（Erythromycin；CAS:114-07-8）、氯霉素（Chloramphenicol；CAS:56-75-7）。

1.1.3 中药材 本试验中53 种中药材均购于贵州省药材总公司，具体如下：大青叶、穿心莲、板蓝根、贯众、野菊花、蒲公英、鱼腥草、紫花地丁、土茯苓、拳参、马齿苋、大血藤、射干、败酱草、金银花、连翘、青果、白花蛇舌草、黄柏、龙胆草、黄芩、秦皮、白鲜皮、苦参、盐酸小檗碱、淡竹叶、柴胡、苍耳子、大黄、牡丹皮、藿香、獐牙菜、鸭跖草、元宝草、马鞭草、千里光、番泻叶、重楼、蛇床子、牛蒡子、淡豆豉、栀子、山慈菇、百斂、马勃、山豆根、紫草、木蝴蝶、一朵云、一点红、六月雪、爵床、独角莲。

1.1.4 培养基 TSB 培养基、TSA 培养基（购自北京索莱宝生物科技有限公司）。

1.2 仪器设备 本试验所用仪器见表1。

表1 试验所用仪器

1.3 方法

1.3.1 培养基的配制 TSB 培养基的配制：准确称取TSB 30.0 g 溶解于1000 ml 重蒸水中，分装，121 ℃高压灭菌15 min 后置于4 ℃下保存备用。

1.3.2 菌种的传代培养及保存 表皮葡萄球菌于TSA平板划线，静置37 ℃培养12～18 h，挑取单菌落于TSB培养基中，置37 ℃水浴震荡摇床中培养12～18 h[10]。1%转接于相同条件下再培养12～18 h[11]。经活化好的细菌置4 ℃冰箱中保存备用。甘油保存：取与已灭过菌的50%甘油等量的转接培养12～18 h 的表皮葡萄球菌于无菌的离心管中，置-20 ℃保存[12]。

1.3.3 甲氧西林对表皮葡萄球菌的MIC 测定 根据美国临床实验室标准化协会（CLSI）规定的肉汤稀释法敏感性试验执行标准，进行表皮葡萄球菌对甲氧西林最小抑菌浓度（MIC）的测定[13]。首先，将表皮葡萄球菌接种于TSB 培养基中，37 ℃培养过夜，再利用TSB 培养基对其进行稀释至1.0×105～1.0×106cfu/ml，将细菌混悬液无菌96 孔培养板中，其中第1 个孔加180 μl，其余各孔加100 μl；其次，精确称取甲氧西林溶于重蒸水中，配制为1280 μg/ml，加入到第1 个孔中，混匀，取100 μl 细菌混悬液加入到第2 个孔中，混匀，依次稀释，至第12 个孔，最终从第12 各孔中吸取100 μl，将其弃去；最后，按照CLSI 推荐的方法，即以肉眼观察无细菌生长的最低药物浓度，即为凝固酶阴性葡萄球菌对甲氧西林的MIC，试验重复3 次。

1.3.4 体外诱导以甲氧西林 作为诱导药物，采用实验室体外强诱导方法获得MRSE。首先将药物进行倍比稀释，浓度从高到低依次为8MIC（4 μg/ml）、4MIC（2 μg/ml）、2MIC（1 μg/ml）、MIC（0.5 μg/ml）、1/2MIC（0.25 μg/ml）和1/4MIC（0.125 μg/ml）。然后将过夜培养的表皮葡萄球菌稀释至1.0105 cfu/ml，将其接种于无菌的96 孔板中，每孔180 μl；最后将稀释好的无菌药物依次加入到每孔中，混匀，静置37 ℃培养箱培养24 h。将菌液生长的最大药物浓度孔定义为第一代诱导菌，即P1，将其作为下一代诱导的母菌，重复以上步骤，见图1。对每一代诱导菌进行菌株的PCR 鉴定和MIC 测定，同时对其进行-20 ℃保存。

图1 体外诱导模式图

1.3.5 耐药菌稳定性考察 为了考察上述获得耐药菌株的稳定性，利用无甲氧西林的TSB 培养基对耐药突变菌进行连续传10 代，依次取0、2、4、6、8 和10代的菌株进行MIC 测定，试验重复3 次。

1.3.6 耐药菌对多种抗菌药物敏感性测定 根据CLSI 规定的肉汤稀释法敏感性试验执行标准[12]，以MRSE 为研究对象，测定其对卡那霉素、庆大霉素、链霉素、阿米卡星、阿奇霉素、苯唑西林、螺旋霉素、红霉素、青霉素、头孢西丁、氨苄青霉素、四环素、替加环素、左氧氟沙星、氯霉素、利福平、利奈唑胺、克林霉素及万古霉素的敏感性，试验重复3 次。

1.3.7 中药材水提取物制备 称取中药材各30 g，以5倍体积水150 ml 回流提取3 次，2 h/次，合并提取液，用旋转蒸发仪浓缩得浓缩膏后置ZK-82B 型真空干燥箱中60 ℃下浓缩至浸干得半成品，检测后经粉碎、过筛混合获取干燥粉末3 g，1 g 粉末相当于原药10 g，低温干燥处储存备用，具体步骤见图2。

图2 中药水提物制备流程

1.3.8 中药水提物对甲氧西林耐药表皮葡萄球菌敏感性测定 根据CLSI 规定的肉汤稀释法敏感性试验执行标准，进行表皮葡萄球菌对上述中药水提物MIC 的测定[13]。将表皮葡萄球菌接种于TSB 培养基中，37 ℃培养过夜，再利用TSB 培养基对其进行稀释至1.0×105～1.0×106cfu/ml，将细菌混悬液无菌96孔培养板中。每1 个孔加100 μl，精确称取中药提取物0.8 g 溶于10 ml 肉汤培养基，配制为80 mg/ml，利用0.22 μm 的微孔滤膜对其进行过滤，取滤好的药液100 μl 加入到第1 个孔中，混匀，取100 μl 细菌混悬液加入到第2 个孔中，混匀，依次稀释，至第12 个孔；从第12 个孔中吸取100μl，将其弃去；最后，按照CLSI 判定标准，读取中药水提物对MRSE的MIC。以上试验重复3 次。

2 结果

2.1 甲氧西林对表皮葡萄球菌的MIC 根据美国CLSI 判定标准，表皮葡萄球菌对甲氧西林的MIC 为2 μg/ml，处于敏感水平。

2.2 甲氧西林耐药表皮葡萄球菌的获得 通过强诱导法，利用甲氧西林对表皮葡萄球菌进体外诱导，结果见图3，在诱导到第21 天时，表皮葡萄球菌对甲氧西林MIC 为64 μg/ml，与诱导初始相比，增加了32 倍；根据CLSI 标准判定，该菌对甲氧西林处于耐药水平。同时，MRSE 稳定性考察结果见图4，表明该耐药菌稳定性良好。

图3 甲氧西林体外诱导下表皮葡萄球菌敏感性变化

图4 MRSE 稳定性测定

2.3 耐药表型试验结果 MRSE 对苯唑西林、青霉素G、四环素、氨苄西林药物产生了交叉耐药性，见表2。2.4 53 种中药水提物对MRSE 的MIC 测定试验结果 金银花、连翘对MRSE 的最小抑菌浓度（MIC）均为2.5 mg/ml，败酱草、黄芩、野菊花、一点红对MRSE 的MIC 为5 mg/ml，大黄、蒲公英、爵床及六月雪对MRSE 的MIC 均为10 mg/ml；其余中药水提物MIC 均＞40 mg/ml，见表3。

表2 表皮葡萄球菌对多种抗菌药物敏感性测定

表3 MRSE 对多种中药水提物敏感性测定

3 讨论

3.1 耐药菌株获得方式 目前，耐药菌株的获得方式主要有两种，即临床分离耐药菌株和实验室体外诱导获得的耐药菌株。其中，临床分离具有具有典型的耐药表型以及临床意义，但是由于其用药的复杂性以及不确定性，导致其耐药表型的产生具有复杂背景，不利于交叉耐药的研究。因此，实验室体外诱导获得耐药菌株具有清晰的用药背景，更适合交叉耐药性的研究。

实验室体外诱导的方式主要有两种，一种为弱选择压力下的诱导，即将细菌处于1/8 MIC 药物浓度下进行连续传代培养；另一种为强选择压力下的诱导，即将每一代生长的最大药物孔的细菌作为母菌进行传代，逐渐增加其药物浓度。研究结果表明，强选择压力下细菌更容易诱导出高水平耐药菌，且更容易出现对其他药物的交叉耐药现象，与既往研究一致[14]。本研究目的在于研究甲氧西林选择压力下，对多种抗生素出现交叉耐药表型，通过强选择压力的诱导方法获得耐药菌株。

3.2 多重耐药表型分析 耐药性问题是影响抗菌药物治疗血流感染的重要因素[15]，本次试验研究通过对表皮葡萄球菌进行敏感性及耐药性分析，发现MRSE 对苯唑西林、青霉素G、氨苄西林、四环素呈现多重耐药性，与既往研究一致[16]。甲氧西林是属于能耐青霉素酶的半合成青霉素[17]，其与临床治疗中常用的青霉素类和头孢菌素类在结构上存在一定相似性。因此，MRSE 对β-内酰胺类抗生素全都表现出耐药性。

3.3 中药水提物抗菌研究 本实验选取不同种类中药对MRSE 进行抗菌活性的系统筛选，分析不同类别中药的对其抗菌活性，通过53 种中药水提物对MRSE 的MIC 测定可知，败酱草、金银花、连翘对其抗菌活性较强；其次为野菊花、大黄以及一点红；最后为黄芩、蒲公英、爵床以及六月雪。根据证治理论，抗菌中药多集中选取清热解毒药和清热燥湿药[18]。其中，清热解毒药主要具有清热解毒的作用，适用于各种热毒病症，如疮痈、丹毒、斑疹、咽喉肿痛、痄腮及痢疾等[19]。现代研究表明，这些病症多属于细菌感染性疾病范畴，主要由细菌和病毒感染引起。临床上应用清热解毒药治疗各种感染性疾病已屡见不鲜，而且取得一定的疗效。清热燥湿药则是以清热燥湿为主要功效的一类药物，可用于治疗一些细菌感染引起的痢疾、阴道炎、急性肠炎等。研究证实[20]，黄连、黄柏、黄芩、苦参、秦皮、龙胆等中药具有不同程度的抑菌作用。此外，其余抗菌中药可归属于清热泻火药、解表药、攻下药、清热凉血药和化湿药；其中部分中药都具有一定程度的抗菌抑菌效果。

综上所述，在甲氧西林强选择压力下，表皮葡萄球菌进化为甲氧西林耐药菌株；MRSE 对苯唑西林、青霉素G、氨苄西林和四环素产生交叉耐药；败酱草、黄芩、金银花、连翘、大黄、野菊花、蒲公英、一点红、爵床以及六月雪对MRSE 具有抗菌活性。