乳铁蛋白在婴幼儿配方奶粉中的功能及其检测方法

揭良，苏米亚，贾宏信，陈文亮

乳业生物技术国家重点实验室，上海乳业生物工程技术研究中心，光明乳业股份有限公司乳业研究院（上海 200436）

乳铁蛋白（lactoferrin，Lf）是一种主要由乳腺上皮细胞分泌的非血红素铁结合糖蛋白。作为母乳中乳清蛋白的主要成分之一，乳铁蛋白占总乳蛋白的10%～20%[1]。与酪蛋白和其他乳清蛋白成分相比，除能够给婴幼儿提供大量的必需氨基酸外，Lf具有抗微生物、促进肠道发育、促进铁吸收、免疫调节等功能，是母乳中对婴幼儿健康非常重要的一种营养物质[2-4]。母乳喂养婴儿比人工喂养婴儿更健康，肠道感染及其他感染性疾病、过敏性疾病发生率均较低。许多研究表明母乳喂养儿具有更好免疫力[5]。成熟母乳中Lf浓度为1～3 g/L，牛常乳中为0.1～0.4 g/L，母乳Lf浓度高出牛乳约20倍[6]。

国外对于Lf的研究和应用较早，我国也在GB 14880—2012《食品安全国家标准食品营养强化剂使用标准》中将其列为营养强化剂，允许在婴幼儿配方食品中使用，并规定其在婴幼儿配方食品中的使用限量为≤1.0 g/kg[7]。自此，国内各大婴幼儿奶粉企业纷纷推出添加Lf的婴幼儿配方奶粉产品，从而使通过添加Lf升级奶粉品质成为一种共识。2016年公布的GB 1903.17—2016《食品安全国家标准 食品营养强化剂 乳铁蛋白》中有规定以乳及乳制品制得的Lf原料的检测方法[8]。但对于食品中特别是婴幼儿配方奶粉中Lf的检测方法一直处于空缺状态。

对Lf在婴幼儿配方奶粉中的作用及对婴幼儿健康的影响进行介绍，探讨婴幼儿配方奶粉中Lf的检测方法。

1 乳铁蛋白在婴幼儿配方奶粉中的功能

Lf独特的结构特性提供多种营养和生理功能。其营养价值至少有2个方面：一是作为氨基酸的膳食蛋白源；二是有利于铁的生物利用。生理功能主要包括抗菌作用、调节肠道菌群、免疫调节、抗病毒[3-4]。因此，将Lf有效合理地应用于婴幼儿配方奶粉中，既可满足非母乳喂养的婴儿生长营养需要，同时又对婴儿的健康起到保护作用。

1.1 铁吸收的调节作用

缺铁是人体最常见的营养缺乏之一，Lf被越来越多的人认为是一种安全有效的成分，可以向缺乏铁的婴幼儿体内运送铁[9]。铁一般是在十二指肠被吸收利用，而在被吸收前，生理pH条件下形成的三价铁离子（Fe3+）不溶于水，很难被婴幼儿体内利用，而Lf通过结合Fe3+，防止沉淀的生成，促进机体细胞对铁的吸收和利用。同时肠细胞表面存在乳铁蛋白受体，能够高亲和性、可逆性地与乳铁蛋白结合，完成铁在十二指肠细胞的吸收[10]。19世纪90年代，国外Kawakami等[11]对比缺铁贫血大鼠Lf和硫酸亚铁吸收铁的情况发现，与亚铁盐中的铁相比，Lf中的铁更容易通过肠黏膜被吸收。

国内外婴幼儿配方奶粉中铁的强化来源仍然是以磷酸亚铁、葡萄糖酸亚铁、柠檬酸铁铵等为主，其吸收利用率极低，且对肠道有一定刺激作用[12]。在补充铁剂时如能同时增补Lf，则可明显减缓铁离子对肠道的刺激作用，同时增强铁的实际吸收量和生物利用率[13]。关于婴幼儿缺铁而导致的神经发育障碍的预防，以膳食补充铁剂为主，而机体无排泄铁的机制，过段的补充铁制剂容易产生铁过量及刺激肠道的风险。因此，乳铁蛋白可作为一种很好的补铁剂添加到婴幼儿配方奶粉。

1.2 乳铁蛋白抗微生物作用

Lf属于广谱抑菌剂，可具有抑制肠道的大肠菌和梭状芽孢杆菌的增殖，改善肠道菌群。研究表明，抗菌活性证实Lf具有广谱抗菌作用（表1）[14-15]，且其水解产物乳铁素具有广谱的抗菌能力和不易产生耐药性[16]。Lf与溶菌酶联合作用能增强其抗菌效果[17]。在早期研究中，认为Lf的抗菌活性是由于其对铁的高亲和力，使细菌不能利用环境中的Fe3+[10]。然而，后来的研究发现，即使是铁饱和形式的Lf依然能抑制许多菌株的生长[18]。这意味着Lf的抗菌性并不完全依赖于铁的结合或清除。研究发现乳铁蛋白可破坏细胞膜的结构，增加其通透性，最终杀灭菌体及抑制细菌细胞膜的生产，阻止细菌粘附于宿主细胞[19]。因此Lf的抗微生物的效果与其和细菌的相互作用方式相关。

表1 乳铁蛋白的抗菌作用

在巴氏杀菌温度范围内，加热对牛乳Lf抗菌活性影响不大，过高的温度（90～120 ℃）会使牛乳铁蛋白变性[20-21]，从而使其抗菌活性大幅下降。依据乳铁蛋白不耐高温的特性，婴幼儿配方奶粉生产中乳铁蛋白一般采用干法添加，可以保留Lf活性。

1.3 乳铁蛋白免疫调节和抗病毒作用

Lf具有抑制病毒、免疫调节的作用[4]。Lf的免疫调节和抗病毒活性同其与免疫系统细胞上的特定细胞表面受体相互作用，以及与病原体相关分子模式结合的能力有关[22]。Lf可作为天然屏障，保护呼吸道和肠黏膜免受病毒的侵袭；乳铁蛋白能够隔离细胞中的游离铁。因为游离铁能够导致病毒复制，造成炎症。体外模拟试验表明，乳铁蛋白具有促进抗体生成T细胞成熟淋巴细胞增殖、活化自然杀伤细胞及抑制混合淋巴细胞释放IL-1、IL-2和TNF-α等多种免疫调节功能[23]。《中国居民奶及奶制品消费指导》称牛奶中含有的Lf是公认的具有多效免疫调节活性的蛋白质。最近的一项研究表明，Lf可以作为天然屏障，逆转与病毒定殖相关的铁紊乱，并通过下调促炎细胞因子来调节免疫应答，从而对抗新型冠状病毒感染和炎症[24]。在病毒侵染的早期，Lf能及时防止病毒对宿主细胞的识别和入侵，因此具有一定的抗病毒活性。

2 乳铁蛋白与婴幼儿健康的临床证据

含Lf的婴幼儿配方奶粉能降低宝宝呼吸道疾病、腹泻、新生儿坏死性小肠结肠炎等发生风险[4]。

美国的一项随机双盲对照试验研究发现，试验组（高剂量Lf婴幼儿配方粉）喂养的婴幼儿哮喘发病率明显低于对照组（低剂量Lf婴幼儿配方粉）喂养儿[25]。在中国四川的一项针对反复呼吸道感染患儿的随机对照试验也获得类似的结果[26]。因此针对呼吸道感染幼儿在常规治疗的同时，给予补充Lf可改善其治疗效果。Ochoa等[27]在秘鲁开展一项健康婴幼儿的随机对照试验，结果发现Lf补充组的婴幼儿腹泻发病率以及腹泻时间明显降低。提示Lf对腹泻发生的预防效应。Manzoni等[28]观察补充Lf对新生儿坏死性小肠结肠炎的健康效发现，Lf组坏死性小肠结肠炎发病率为2.0%，显著低于安慰剂组的5.4%。Akin等[29]在土耳其开展的双盲随机安慰剂对照研究得出类似结果。结果显示Lf可降低极低出生体重儿坏死性小肠结肠炎的发病率和死亡率。

3 乳铁蛋白的检测研究

GB 14880—2012《食品营养强化剂使用标准》中规定Lf可用于婴幼儿配方食品，但关于婴幼儿配方奶粉中Lf的检测方法一直未发布国家标准检测方法，而GB 1903.17—2016《食品安全国家标准 食品营养强化剂 乳铁蛋白》附录A中的检测方法只适用于以乳及乳制品为原料制得的Lf原料的检测，并不适用于食品中Lf的检测。针对婴幼儿配方奶粉中Lf的检测主要方法有酶联免疫法、高效毛细管电泳法和高效液相色谱法3种。

酶联免疫法作为一种高选择性、高灵敏度的分析方法，被广泛应用于临床医学和生物学领域[30]。但该方法易受杂质峰的干扰，而奶粉成分复杂，此外，当筛选大量样本时，这种微量滴度平板免疫测定法的每日重复性相当低。这就需要检测人员根据具体婴幼儿配方奶粉对其样品处理进行优化，避免杂质峰对特征峰的干扰。吴春香等[31]采用Lf速检测试剂盒，通过酶联免疫吸附法定量测定婴儿配方奶粉中的Lf含量，并验证该方法的准确性、稳定性和可靠性。因此从研究来看，经过优化后酶联免疫吸附法也能准确测量婴幼儿配方奶粉中的Lf。

高效液相色谱法是以三氟乙酸和乙腈为流动相，在硅基柱（C4或C8）上采用高效液相色谱法测定牛奶粉中的Lf。高效液相色谱法在食品、日用品、药物等行业得到广泛应用。国内大部分婴幼儿配方奶粉企业主要是采用液相色谱法检测Lf。2019年发布《食品安全标准 食品中乳铁蛋白的测定（征求意见稿）》中推荐的方法是高效液相色谱法。然而，该方法的分辨率不足以从牛乳蛋白中把乳铁蛋白分离出来，这导致检测结果的重复性差[32]。因此许多学者对于婴幼儿配方奶粉中Lf的最佳检测方法仍然存在争议。

高效毛细管电泳法是在样品经脱脂、酸法去除酪蛋白和硫酸铵沉淀富集、纤维素滤膜过滤净化等方法进行预处理后，采用毛细管电泳仪进行分离检测。毛细管电泳操作步骤繁琐且分离蛋白质可能会受到蛋白质吸附在毛细管壁上的影响，结果重复性差，色谱带宽，样品回收率低[33]。研发发现在毛细管电泳法分析Lf时，可能由于婴儿配方奶粉样品中等电点较高，Lf浓度较低，Lf与其他乳清蛋白的分离效果较差[34]。

4 结语与展望

Lf是一种天然、具有许多特殊生理功能的母乳中重要活性蛋白。Lf具有的辅助治疗婴幼儿腹泻、新生儿坏死性小肠结肠炎、呼吸道疾病、改善婴幼儿贫血和促进其生长发育的营养和生理功能，使其在婴儿配方奶粉食品中得到广泛应用。LF的其他功能特性（如抗病毒和抗癌活性）也引起研究关注，显示在开发新药物和疫苗方面的潜力。但婴幼儿配方奶粉中Lf的分析一直是一项具有挑战性的工作，故针对婴幼儿配方食品中Lf的高效、准确的检测方法的研究对其应用具有重要意义。