苯醚甲环唑胶体金试纸条的研制及其应用

崔廷婷，朱亮亮，谭晨，王健，王兆芹，万宇平*

1. 北京勤邦生物技术有限公司（北京 102206）；2. 北京市食品安全免疫快速检测工程技术研究中心（北京 102206）；3. 河北北方学院（张家口 075000）

苯醚甲环唑（difenoconazole），又名恶醚唑，是一种广谱高效的三唑类内吸性杀菌剂，能够强烈地抑制细胞壁甾醇的生物合成，从而破坏细胞膜的结构和功能，最终阻止真菌生长[1-2]。其具有保护和治疗作用，可以防治炭疽病、灰腐病、霜霉病、白粉病和叶枯病等常见病症，被广泛应用于谷物、水果、蔬菜、茶叶等作物[3]。但由于是直接喷洒在作物上，进而通过食用进入人体，可能会危害人体健康[4]，因此GB 2763—2021《食品安全国家标准食品中农药最大残留限量》中规定不同食品中苯醚甲环唑的残留限量[5]。

已报道的检测苯醚甲环唑的方法主要为气相色谱法[6-7]、液相色谱法[8-9]及色谱-质谱联用技术[10-12]等常规的仪器分析方法。这些方法均须在实验室条件下操作，样品前处理繁琐费时，还需配备昂贵的仪器设备，检测成本较高、耗时长、操作复杂，在实际应用中具有很大的局限性，难以满足大量样品现场快速检测的需要。食品安全检测朝着快速便捷的方向发展，试验旨在建立一种简单快速、适用于蔬菜中苯醚甲环唑残留的胶体金免疫层析试纸条方法，以满足大量样品现场筛选和监控。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

苯醚甲环唑、腈菌唑、三唑醇、三唑酮、烯唑醇、氟环唑、己唑醇、戊唑醇、戊环唑、粉唑醇、丙环唑标准品（纯度均≥98%，德国Dr. Ehrenstorfer GmbH公司）；牛血清白蛋白（BSA）、卵清蛋白（OVA）、Triton X-100、羊抗鼠IgG（美国Sigam公司）；碳酸钾、吐温-80、蔗糖、乙醇（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；硝酸纤维素膜（NC膜，德国Sartorius公司）；样品垫、结合物释放垫、吸水垫、PVC底板（上海捷宁生物科技有限公司）；胶体金溶液、苯醚甲环唑单克隆抗体、苯醚甲环唑半抗原-OVA偶联物（北京勤邦生物技术有限公司实验室自制）。

复溶缓冲液采用含BSA质量分数0.1%～0.3%、吐温-80质量分数0.05%～0.2%、pH 7.2的0.02 mol/L磷酸盐缓冲液；样本提取液采用pH 7.0的0.02 mol/L磷酸盐缓冲液。

1.2 仪器与设备

SBCJ磁力搅拌加热器（河南圣亚仪器仪表有限公司）；TGL16C台式高速冷冻离心机（湖南湘立科学仪器有限公司）；XYZ3060三维喷点平台（美国Bio-Dot公司）；CTS300数控裁条机、ZQ2402微电脑自动斩切机（上海金标生物科技有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 苯醚甲环唑单克隆抗体-胶体金标记物的制备

磁力搅拌下，用0.2 mol/L碳酸钾溶液调节胶体金溶液至pH 7.2，按每毫升胶体金溶液中加入25 μg抗体的标准向其中加入苯醚甲环唑单克隆抗体，继续搅拌混匀30 min；静置10 min后加入10% BSA，使其在胶体金溶液中的终浓度为1%，静置10 min；按12 000 r/min、4 ℃离心40 min，弃上清液，沉淀用复溶缓冲液洗涤2次，用体积为初始胶体金体积1/10的复溶缓冲液将沉淀重悬，置4 ℃备用。

1.3.2 试纸条的制备与组装

在NC膜上包被T线（苯醚甲环唑半抗原-OVA偶联物，质量浓度1 mg/mL，包被量0.9 μL/cm）和C线（羊抗鼠IgG，质量浓度200 μg/mL，包被量0.9 μL/cm），包被好后于37 ℃过夜干燥；在结合物释放垫上喷涂苯醚甲环唑单克隆抗体-胶体金标记物制成金标垫，0.01 mL/cm，喷好后37 ℃干燥1 h。将NC膜、样品垫、金标垫、吸水垫及PVC底板组装后切成3 mm宽的小条，装在特制的塑料卡中，置于锡箔袋中，加干燥剂密封保存。试纸条的结构见图1。

图1 试纸条剖面结构示意图

1.3.3 胶体金免疫层析条件优化

1.3.3.1 包被原和二抗包被液的选择

将包被原和羊抗鼠IgG分别用1#～4#包被液（表1）稀释后，用点膜仪喷涂到NC膜上形成T线和C线，组装试纸条检测阴性西蓝花样品，比较显色情况，选择C、T线显色最合适的包被液作为包被原和二抗最佳包被液。

表1 包被液的优化

1.3.3.2 金标垫和样品垫封闭液的选择

将样品垫、结合物释放垫分别用1#～5#溶液（表2）浸润后，37 ℃干燥；用喷膜仪将苯醚甲环唑单克隆抗体-胶体金标记物均匀喷涂到已封闭的结合物释放垫上，制成金标垫。将不同封闭液处理的金标垫和样品垫组合，与喷有包被原和二抗的NC膜、吸水垫组装试纸条，检测阴性西蓝花样品，比较显色情况，选择C、T线显色和层析速度最合适、没有背景色的试纸条对应的封闭液作为金标垫和样品垫最佳封闭液。

1.3.4 样品处理及检测

取新鲜样品擦去泥土，剪碎成小于1 cm见方的碎片；称取（2.00±0.05）g样品至离心管中，加入6 mL样本提取液，上下振荡30 s，静置1 min，上层清液即为待检液。取70 μL待检液垂直滴加于试纸条加样孔中，反应10 min判定结果。结果判定示意图见图2。

图2 结果判定示意图

1.3.5 试纸条性能指标的确定

1.3.5.1 检测限

在空白新鲜西蓝花中添加苯醚甲环唑标准品，分别至质量浓度为0，0.1，0.2，0.5和1.0 mg/kg，用试纸条进行检测，每个浓度重复2次，根据结果确定试纸条检测限。

1.3.5.2 准确性

取空白新鲜西蓝花、彩椒、大白菜、黄瓜、菜豆、洋葱样品，各10份，分别添加苯醚甲环唑标准品至质量浓度大于等于检测限，用试纸条进行检测，计算假阳性率和假阴性率。

1.3.5.3 特异性

分别向空白西蓝花样品中添加其他常见的三唑类杀虫剂（腈菌唑、三唑醇、三唑酮、烯唑醇、氟环唑、己唑醇、戊唑醇、戊环唑、粉唑醇、丙环唑）至质量浓度10 mg/kg，用试纸条进行检测，每种药物重复2次，根据结果判定试纸条特异性。

2 结果与分析

2.1 包被原和二抗包被液的优化

由表1可知，包被液中添加物不同会影响C、T 线呈色，4#包被液处理的显色清晰，色泽好，因此选用4#包被液，即0.02 mol/L pH 7.4 PB+2%乙醇混合溶液作为包被原和二抗的最佳包被液。

2.2 金标垫和样品垫封闭液的优化

在金标垫和样品垫的封闭过程中，常选用一定的BSA和蔗糖封闭玻璃纤维膜的孔隙，减少非特异性吸附，同时还加入表面活性剂以利于层析反应的进行[13]。选择5种封闭液处理玻璃纤维膜，制备金标垫和样品垫，观察不同封闭液处理的试纸条C、T线显色和试纸条背景色情况，结果见表2。

表2 封闭液的优化

封闭液中加入蔗糖，能使C、T线显色变深，不含蔗糖的1#和3#封闭液处理的C、T线显色较浅；另外，封闭液中加入表面活性剂Triton X-100能有效减弱背景色，如3#，4#和5#封闭液中含有0.05% Triton X-100，无背景色，而其他封闭液处理的大都有背景色。4#封闭液处理的金标垫和样品垫C、T线显色合适，且无背景色，因此选用4#封闭液，即0.02 mol/L pH 7.4 PB+0.5% BSA+0.05% Triton X-100+2.5%蔗糖混合溶液作为金标垫和样品垫的最佳封闭液。

2.3 检测限

由图3可知：随着苯醚甲环唑质量浓度的增加，T线显色逐渐变浅；直至浓度0.5 mg/kg时，T线显色明显弱于C线显色，检测结果呈阳性。因此，可判定此次研究开发的胶体金试纸条的检测限为0.5 mg/kg。

图3 苯醚甲环唑试纸条检测限结果

2.4 准确性

用试纸条检测空白蔬菜样品及添加苯醚甲环唑至0.5 mg/kg的加标阳性蔬菜样品各60份，结果显示：空白蔬菜样品的检测结果中出现2个阳性，假阳性率为3.33%；苯醚甲环唑添加浓度0.5 mg/kg的阳性蔬菜样品检测结果全为阳性，假阴性率为0。由于胶体金免疫层析法是通过肉眼观察判断T线与C线颜色的变化来确定样本阴阳性，具有一定主观性，可能会出现假阳性问题[14]。

2.5 特异性

由表3可知，苯醚甲环唑试纸条检测与其具有类似功能或结构的农药时，结果均为阴性，即与其他三唑类杀虫剂无交叉反应，具有较好的特异性。

表3 苯醚甲环唑试纸条特异性结果

3 结论

试验以胶体金标记苯醚甲环唑单克隆抗体，在优化包被原和二抗包被液、金标垫和样品垫封闭液等免疫层析条件下，基于竞争抑制反应原理，研制苯醚甲环唑快速检测试纸条，并应用于蔬菜检测中。该试纸条对西蓝花、彩椒、大白菜、黄瓜、菜豆、洋葱等蔬菜中苯醚甲环唑的检测限为0.5 mg/kg，可满足GB 2763—2021[5]中规定的最大残留限量；该试纸对其他三唑类杀虫剂无交叉反应，可特异性地检测蔬菜中苯醚甲环唑的残留；假阳性率为3.33%，假阴性率为0，检测时间＜15 min，适用于基层实验室大批量样本检测及田间地头的现场快速检测。

在试纸条应用过程中发现，由于胶体金免疫层析法是通过肉眼观察判断T线与C线颜色的变化来确定样本阴阳性，容易受产品熟悉程度及试验人员经验的影响，可能会出现假阳性问题，因此后续研制中可以通过匹配胶体金读数仪来进行准确定量。但考虑到免疫检测的固有属性，仍不能完全排除假阳性的出现，因此对于检测结果中出现的阳性样本，还需要用国家标准中规定的仪器方法进行确证。而且GB 2763—2021中规定有最大残留限量的食品种类较多，试纸条仅调试西蓝花、彩椒、大白菜、黄瓜、菜豆、洋葱6种蔬菜，样本量较小，可在后续应用中扩大样本种类和数量，以更好地应用于食品中农药残留的监控。