花生红衣原花青素对冷鲜猪肉脂质氧化的影响

黄武，侯晓杰，侯旭杰*，王强

1. 塔里木大学生命科学学院，南疆特色农产品深加工兵团重点实验室（阿拉尔 843300）；2. 中国农业科学院农产品加工研究所（北京 100193）

我国是生产和消费猪肉的大国，猪肉在国民的生产、生活中发挥重要作用[1]，但它在运输储藏期间易受温度、氧气等环境因素的影响而发生氧化变质，严重影响消费者的可接受性和相关商品货架期。因此，抗脂质氧化成为冷鲜猪肉保鲜的关键。工业生产中最常用的方法是添加丁羟基茴香醚等人工合成添加剂来解决肉品的保鲜问题[2]。但人工抗氧化剂具有一定的安全风险，使用不当将危害人体健康，甚至有致癌的可能[3]。天然抗氧化剂因具有抗氧化能力强、安全无害等优点[4]，成为近年来研究的热点。

花生红衣是花生精深加工过程中的副产物，产量巨大，但利用率较低。经研究发现，花生红衣中含丰富的多酚类物质，包括白藜芦醇、原花青素、酚酸等[5-6]，其中原花青素是一种很强的抗氧化物质，它在人体内的抗氧化能力是VC的20倍，VE的50倍[7]，可用作安全无毒的新型天然抗氧化剂[8-9]。若能充分利用花生红衣中的原花青素，将获得较为可观的经济效益[10]。试验以花生红衣为原料，通过UPLC-Q-TOF/MS分析其中原花青素组成成分，以不同浓度原花青素和1%的VC对猪肉肥膘进行处理，研究不同冷藏时间段猪肉肥膘的酸价、POV和TBA值，考察原花青素对猪肉脂肪氧化的保护作用；比较VC和原花青素对ABTS自由基和DPPH自由基的清除情况，以期为花生红衣原花青素作为天然抗氧化剂运用于肉制品加工中提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

市售新鲜猪肉，选取肥膘部分。

ABTS[≥98%，阿法埃莎（天津）化学有限公司]；DPPH[≥97%，梯希爱（上海）化成工业发展有限公司]；无水乙醇、TBA（天津市北联精细化学品开发有限公司）；三氯乙酸（上海山浦化工有限公司）；过硫酸钾、氢氧化钾、冰乙酸、异丙醇、硫代硫酸钠（天津市致远化学试剂有限公司）；乙醚（成都市科隆化学品有限公司）；三氯甲烷（西安化学试剂厂）；VC（上海源叶生物科技有限公司）；碘化钾（山东西亚化学工业有限公司）。试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

超高效液相色谱串联质谱仪（Waters ACQUITY UPLC/Xevo G2 QTOF MS，Waters中国有限公司）；数控超声波清洗器（SB-5200DT，宁波新芝生物科技股份有限公司）；循环水式多用真空泵（SHB-Ⅲ，郑州长城科工贸有限公司）；数显恒温磁力搅拌水浴锅（EMS-20，金坛市科顺仪器厂）；旋转蒸发器（RE-3000A，上海亚荣生化仪器厂）；高速冷冻离心机（TGL-20br，上海安亭科学仪器厂）；紫外可见光分光光度计（UV-2450，岛津公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 花生红衣原花青素的制备

称取干燥花生红衣，粉碎成粉末状，用适量石油醚对红衣粉进行脱脂，参考王菲等[11]的方法对其中原花青素进行提取，经大孔树脂纯化，将纯化后的溶液旋转浓缩到一定程度后，真空冷冻干燥制成原花青素冻干粉备用[12-14]。

1.3.2 花生红衣原花青素成分分析

称取试验所制纯化后的原花青素冻干粉，用甲醇配制成质量浓度2 mg/mL溶液，过0.45 μm滤膜后进行UPLC-Q-TOF/MS分析。

色谱条件：色谱柱ACQUITY UPLC HSS T3柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm，Waters公司）；柱温35 ℃。流动相为0.1%甲酸水（A）-乙腈（B）；梯度洗脱程序为0～30 min，5%～90% B，30～45 min，90%～100% B，45～50 min，100% B。进样量3 μL，流速0.3 mL/min。

质谱条件：质谱分析由Q-TOF MS（MS/MS）完成，电喷雾离子源（ESI），毛细管电压3.00 kV；锥孔电压40 V；离子源温度和脱溶剂温度分别为100 ℃和500 ℃；雾化气（N2）和脱溶剂气（N2）流速分别为100 L/h和950 L/h。质谱数据采集范围50～1 200 mDa，采集时间0～60 min，扫描时间0.1 s。

1.3.3 抗脂质氧化研究

1.3.3.1 样品处理

市购新鲜猪肉肥膘1 500 g，均分30等分，随机分为6组，1～6组分别于无菌水、0.1% VC，以及0.05%，0.10%，0.15%和0.20%的花生红衣原花青素溶液中浸渍1 min后，用保鲜膜包裹严实，置于4 ℃冰箱冷藏保存，分别在第1，3，5，7和9 d测定猪肉的酸价、POV、TBA值。

1.3.3.2 酸价的测定

按照GB/T 5009.229—2016《食品安全国家标准食品中酸价的测定》第一法 冷溶剂指示剂滴定法测定酸价。

1.3.3.3 过氧化物值（POV）的测定

按照GB/T 5009.227—2016《食品安全国家标准食品中POV的测定》第一法 滴定法测定过氧化物值。

1.3.3.4 TBA值（TBARS）的测定

参考芮怀瑾等[15]的研究方法。

1.4 自由基清除能力测定

1.4.1 溶液配制

1.4.1.1 VC溶液的配制

称取0.01 g的VC试剂，用蒸馏水溶解，定量转入100 mL容量瓶中，用蒸馏水定容，摇匀得到质量浓度0.1 mg/mL的VC溶液；用蒸馏水稀释，分别得到质量浓度为0.005，0.010，0.015，0.020和0.025 mg/mL的VC溶液。

1.4.1.2 样品溶液的配制

称取一定量纯化后的原花青素冻干粉，配置成质量浓度0.15 mg/mL溶液，将其稀释至质量浓度为0.002 5，0.005 0，0.007 5，0.010 0和0.012 5 mg/mL。

1.4.2 原花青素对DPPH自由基的清除能力

取5支试管，各取2.0 mL上述不同质量浓度样液与2.0 mL质量浓度0.025 mg/mL的DPPH溶液加入同一试管中；取5支试管，各取2.0 mL上述不同质量浓度样液与2.0 mL无水乙醇溶液加入同一试管中；另取1支试管，取2.0 mL DPPH溶液，加入2.0 mL无水乙醇溶液。将以上试管震荡、摇匀，室温下遮光保存30 min后于500 nm波长处测吸光度，以无水乙醇作空白对照，用VC溶液取代原花青素溶液按相同步骤进行试验作对照。按照式（1）计算其DPPH清除率。

式中：Ai为DPPH溶液与原花青素溶液体系反应的吸光度；Aj为原花青素溶液与无水乙醇体系反应的吸光度；Ac为DPPH溶液与无水乙醇体系反应的吸光度。

VC溶液的DPPH清除率算取方法可代入式（1）计算。

1.4.3 原花青素对ABTS自由基清除能力测定

以无水乙醇作空白，取1.6 mL处理过的ABTS工作液于试管中，加入95%乙醇溶液0.4 mL以及样品提取液0.4 mL，振荡10 s，充分进行混合。混合后静置6 min在734 nm下测其吸光度。采用式（2）计算其ABTS自由基清除率。

式中：A0为不加样品溶液，但加入ABTS的吸光度；Ai加入样品及ABTS的吸光度。

2 结果与分析

2.1 花生红衣原花青素的成分分析

花生红衣原花青素的UPLC色谱图如图1所示。通过UPLC-Q-TOF/MS分析，结果总结在表1中。试验所用花生红衣原花青素中，有至少5种单倍体和10种原花青素低聚物被检测并鉴定。其中，单倍体含儿茶素、表没食子儿茶素没食子酸酯、原儿茶酸及表儿茶素衍生物等，低聚物中A型低聚体4种，B型低聚体6种，包括原花青素A1、A2和C1，已鉴定出的二聚体由表儿茶单体素通过A型连接键连接，或由表儿茶素没食子酸酯与儿茶素通过B型连接键连接，三聚体由表儿茶素单体经B型连接键连接，或由表儿茶素和儿茶素经B型连接键连接。原花青素的出峰时间在4～7 min内较为集中，这可能是因为试验所得原花青素的聚合度普遍较低，分子极性相对较大，相比于聚合度高、极性小的分子在色谱柱上吸附得不是很牢固，所以经过流动相的冲洗能在较短时间内形成峰图。

图1 花生红衣原花青素纯化物超高效液相色谱图

表1 花生红衣原花青素UPLC-Q-TOF/MS的解析结果

2.2 花生红衣原花青素对冷藏猪肉酸价的影响

酸价是衡量脂肪中游离脂肪酸含量的一项指标，酸价的高低能够反映脂肪质量的好坏。由图2可知，各试验组酸价均随着试验天数增长而升高，试验组和对照组酸价均低于空白组，0.1%花生红衣原花青素抑制效果最好，从总体来看，0.1%的VC溶液抑制效果强于0.05%，0.15%和0.20%的花生红衣原花青素，而0.05%，0.15%和0.20%的花生红衣原花青素抑制效果呈依次增大的趋势，出现这种现象的原因还有待进一步的研究。

图2 花生红衣原花青素对冷藏猪肉酸价的影响

2.3 花生红衣原花青素对冷藏猪肉POV的影响

POV是表示油脂和脂肪酸等被氧化程度的一项重要指标，其数值一般表示油脂的初级氧化程度。由图3可知，各试验组POV均随着试验天数增长总体呈线性增高趋势。试验组和对照组所测POV基本都低于空白组，0.2%的花生红衣青素抑制效果最好，从总体来看，原花青素浓度越高，对冷藏猪肉脂肪的初级氧化抑制效果越好，而0.1%的VC抑制效果与0.15%的花生红衣原花青素抑制效果大体相似。

图3 花生红衣原花青素对冷藏猪肉POV的影响

2.4 花生红衣原花青素对冷藏猪肉TBA值的影响

TBA值是表示油脂酸败程度的指标之一，其数值一般表示油脂的次级氧化程度。由图4可知，各试验组TBA值均随着试验天数增长总体呈线性增高趋势。试验组和对照组所测TBA值均低于空白组，0.2%花生红衣青素抑制效果最好，从总体来看，原花青素浓度越高，其对冷藏猪肉脂肪的次级氧化抑制效果越好，而0.1%的VC抑制效果介于0.15%～0.20%花生红衣原花青素之间。

图4 花生红衣原花青素对冷藏猪肉TBA值的影响

2.5 原花青素对DPPH自由基的清除能力

由图5可知，原花青素与VC在各自浓度范围内对DPPH自由基的清除能力呈增强趋势。在相同质量浓度下，原花青素对DPPH清除能力明显较VC强。原花青素中含有大量活性酚羟基，其清除自由基能力是VC的20倍，但由于花生红衣原花青素提取物中含较多杂质，所得原花青素纯度较低，使得自由基清除能力达不到原有效果，但相比于VC，花生红衣原花青素能够更好地清除DPPH自由基。

图5 原花青素对DPPH自由基的清除能力

2.6 原花青素对ABTS自由基的清除能力

由图6可知，原花青素与VC对ABTS自由基清除效果呈同等升高趋势，但在相同质量浓度下，原花青素与VC对ABTS清除率比其对DPPH的清除率低，质量浓度0.005 mg/mL时，原花青素和VC对DPPH自由基清除率分别是71.5%和62.3%，而对ABTS自由基的清除率分别是29.6%和20.9%，两者清除率相差明显，说明花生红衣原花青素能够更好地清除DPPH自由基。相比于VC，花生红衣原花青素对自由基的清除效果更加明显。

图6 原花青素对ABTS自由基的清除能力

3 结语

花生红衣原花青素对猪肉脂肪氧化有一定抑制作用，而通过UPLC-Q-TOF/MS检测分析，其中所含原花青素皆为单倍体或低聚体，与高聚体相比，低聚体原花青素具有更好的稳定性，且经自由基清除效果比较，花生红衣原花青素抗氧化能力优于VC。

脂肪的脂质氧化测定是评价脂肪品质的重要指标，在食品工业生产中，生产者应尽量降低脂肪氧化率，以保证油脂产品的质量与安全，因此，有效、廉价、来源广泛的脂质氧化抑制剂是生产者所期待获取的。花生红衣含有丰富的低聚体原花青素，具有良好的抗氧化效果，其作为脂质抗氧化剂有较为光明的发展前景，并为花生红衣高值化利用提供理论依据。