以藜麦为基质的红茶菌发酵工艺

陈樱之，刘红梅，吕晴，蔡倩倩，肖萍,2*

1. 天津农学院食品科学与生物工程学院（天津 300392）；2. 天津市农副产品深加工技术工程中心（天津 300392）；3. 黄河三角洲京博化工研究院有限公司（滨州 256500）

藜麦原产于南美洲，是一种营养全面的伪谷物。其蛋白质含量高于普通谷物，氨基酸组成合理，属于优质蛋白[1-2]；且富含人体所必需的ω-3和ω-6等多种不饱和脂肪酸和矿物质营养素[3]。随着杂粮产业的快速发展及深入研究，其“绿色、天然、营养”等特性被广大消费者熟知。但是，国内藜麦产品多为初加工，主要是藜麦米，其他深加工产品较少[4]。

红茶菌，又称康普茶，是以茶、糖、水为原料，经过酵母菌、醋酸菌、乳酸菌等多种微生物共同发酵形成的发酵饮品[5]。红茶菌在发酵过程中会产生很多对人体有益的物质，具有抗氧化、降血糖、降血脂等保健功效[6-8]。在以往研究中基本都是以茶叶为发酵基质并对其发酵产品的功能特性进行研究。随着研究的不断深入，其基质呈现出多样式选择，如咖啡豆提取液、橡树树叶、小麦草汁、蛇果、蓍草等[9-13]。但尚未应用于藜麦发酵，这为藜麦的深加工提供了新思路。因此，试验将制备不同形式的藜麦发酵基质，以红茶菌作为菌种，确定藜麦基质的最佳添加方式，在此基础上对红茶菌发酵工艺条件进行优化。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

红茶（福建正山堂茶叶有限公司）；白藜麦（金昌西域神话食品有限公司）；MRS肉汤、YPD培养基（北京索莱宝科技有限公司）；α-淀粉酶、糖化酶（天津市诺奥科技发展有限公司）。

1.2 仪器与设备

SW-CJ-2FD洁净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）；LGR20-W高速冷冻离心机（北京京立离心机有限公司）；STARTER3100实验室pH计[奥豪斯仪器（上海）有限公司]；等。

1.3 试验方法

1.3.1 红茶菌活化

按料水比1∶150 g/mL冲泡茶水后，加入10%白砂糖溶解。冷却后加入红茶菌母液，于25 ℃培养至表面出现薄膜，备用。

1.3.2 指标分析

1.3.2.1 总酚和黄酮质量浓度测定

以没食子酸为标准品，采用Folin-Ciocalten法测定发酵液总酚质量浓度[13]；以芦丁为标准品，采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH法测定发酵液黄酮质量浓度[14]。

1.3.2.2 pH的测定

红茶菌发酵液，以10 000 r/min离心15 min，取上清液，利用pH计测定。

1.3.2.3 微生物指标的测定

发酵液梯度稀释后分别涂布于醋酸菌、MRS和YPD培养基上，其中醋酸菌和酵母菌于30 ℃培养24 h，乳酸菌于37 ℃培养48 h。

1.3.3 藜麦基质添加形式对红茶菌发酵效果的影响

1.3.3.1 藜麦研磨液对红茶菌发酵效果的影响

称取10%白砂糖，充分溶解后加入10%藜麦研磨粉，搅拌均匀后接种10%红茶菌菌液，于25 ℃培养。

1.3.3.2 藜麦水提液对红茶菌发酵效果的影响

按料水比1∶10 g/mL沸水浸提15 min，过滤；加入10%白砂糖，冷却后接种10%红茶菌菌液，于25 ℃培养。

1.3.3.3 藜麦磨浆液对红茶菌发酵效果的影响

藜麦磨浆液的制备参考李兴等[15]的方法。将磨浆液快速加热至沸腾，加入10%的白砂糖，保温5 min；冷却后接种10%菌液，于25 ℃培养。

1.3.3.4 藜麦糖化液对红茶菌发酵效果的影响

藜麦糖化液的制备参考李贞景等[16]的方法。在糖化液中加入10%白砂糖，冷却后接种10%菌液，于25 ℃培养。

1.3.4 以藜麦为基质的红茶菌发酵工艺单因素试验

分别选取料水比（6∶100，10∶100，14∶100和18∶100 g/mL）、加糖量（6%，8%，10%和12%）、接种量（6%，8%，10%和12%）、培养温度（20，25和30 ℃）进行单因素试验。

1.3.5 以藜麦为基质的红茶菌发酵工艺正交试验

综合单因素试验结果，以培养温度、接种量、加糖量、料水比为考察因素，按表1设计进行正交试验。

表1 L9(34)正交试验的因素及水平

2 结果与分析

2.1 藜麦基质添加形式对红茶菌发酵效果的影响

不同藜麦基质添加形式对发酵液中总酚、黄酮质量浓度的影响如图1所示。4种红茶菌发酵液中总酚、黄酮浓度的变化趋势相似，即总酚、黄酮质量浓度呈现先升高再降低趋势，在第2天时质量浓度达到最高值，之后开始逐渐下降，原因可能是发酵时间增加导致发酵液中的酚类、黄酮等营养物质被微生物利用消耗。另外，红茶菌发酵藜麦研磨液时总酚、黄酮质量浓度最高，其次为藜麦水提液和糖化液，藜麦磨浆液作为发酵基质时，其总酚和黄酮质量浓度最低。

图1 藜麦基质添加形式对总酚和黄酮质量浓度的影响

红茶菌发酵液中乳酸菌、醋酸菌和酵母菌的菌落数如图2所示：发酵2 d时，4种发酵液中3种微生物数量均处于最高值，且醋酸菌＞乳酸菌＞酵母菌。研究证明，由茶糖水培养出来的红茶菌菌液中，一般只存在极少量的乳酸菌，甚至检测不到乳酸菌。红茶菌发酵咖啡液时，发酵液中3种微生物数量为酵母菌＞乳酸菌＞醋酸菌[17]。但试验发现乳酸菌数量大于酵母菌。可见，由于发酵基质的营养成分不同会造成发酵液中菌相结构的差异性。

以磨浆液作为基质发酵时醋酸菌数量最高且pH最低[图2（d）]，由此可知，pH的变化可以直接反映醋酸菌的数量变化。同时，在发酵周期内4种发酵液的pH均处于下降趋势，在发酵3～4 d时随着醋酸菌数量的降低，pH逐渐趋于平稳。以藜麦研磨液为基质时，其中的全部营养物质可被微生物利用以供其生长，酵母菌和乳酸菌数量为最高值。而以藜麦水提液为基质时，微生物只能利用溶于水的营养物质，造成微生物数量下降。在制备磨浆液时，可能由于高温破坏藜麦中的热敏感物质，使营养物质含量降低，影响微生物生长。而在制备糖化液时，发现糖化液黏度较高，导致溶解氧较低，影响酵母菌的有氧呼吸，造成数量的减少。有研究表明，红茶菌发酵过程中酵母菌作为“启动子”，在发酵初期会将蔗糖水解成葡萄糖和果糖，并通过进一步糖酵解产生乙醇后醋酸菌开始大量繁殖，而乳酸菌也会利用酵母菌的代谢产物进行生长繁殖[18]，由于酵母菌的减少，所以进行糖化液发酵时醋酸菌和乳酸菌数量也较低。综合以上结果，选择藜麦研磨液作为红茶菌发酵基质。

图2 藜麦基质添加形式对微生物数量及pH的影响

2.2 以藜麦为基质的红茶菌发酵工艺单因素试验

2.2.1 不同料水比对红茶菌发酵效果的影响

如表2所示，随着料水比升高，总酚、黄酮质量浓度及微生物数量处于先升后降趋势。料水比10∶100 g/mL时，除pH外，其他指标均达到最高，随后开始下降。pH在整个过程中一直处于上升趋势，其原因可能是随着料水比增加，发酵液初始pH升高，导致发酵后的pH也相应比较高。综合考虑，选择料水比6∶100，10∶100和14∶100 g/mL进行正交试验设计。

表2 不同料水比对总酚、黄酮质量浓度及pH、微生物数量的影响

2.2.2 不同加糖量对红茶菌发酵效果的影响

当蔗糖添加量为6%～8%时，随着加糖量升高，总酚、黄酮质量浓度及酵母菌、乳酸菌、醋酸菌菌落数升高，pH降低；当加糖量8%时，总酚、黄酮的质量浓度达到最高，此时蔗糖含量维持较丰富水平，菌体优先利用直接营养成分而减少对黄酮、总酚的分解利用，使活性成分更多被保留；当加糖量大于8%时，菌落数开始下降，pH上升（表3）。其原因可能是糖添加过量，发酵液的渗透压较高，从而使微生物的生长受到抑制[19]。综合考虑，选择加糖量6%～10%进行正交试验设计。

表3 不同加糖量对总酚、黄酮质量浓度及pH、微生物数量的影响

2.2.3 不同接种量对红茶菌发酵效果的影响

如表4所示，随着接种量增加，总酚、黄酮的质量浓度和菌落数呈现升高趋势，pH下降。接种量8%时，总酚、黄酮质量浓度和微生物数量达到最高值，pH最低。接种量大于8%时，由于菌体大量生长繁殖，所需要的营养物质会增多，导致发酵原料中的各类成分被过度分解利用，出现含量下降的趋势[20]。因此，选择接种量6%，8%和10%进行正交试验设计。

表4 不同接种量对总酚、黄酮质量浓度及pH、微生物数量的影响

2.2.4 不同培养温度对红茶菌发酵效果的影响

如表5所示，随着温度升高，总酚、黄酮质量浓度以及酵母菌、乳酸菌和醋酸菌数量逐渐增大，25 ℃时达到最高值，之后逐渐降低。

表5 不同培养温度对总酚、黄酮质量浓度及pH、微生物数量的影响

2.3 以藜麦为基质的红茶菌发酵工艺正交试验

正交试验结果采用综合评分法进行分析，黄酮质量浓度、总酚质量浓度及微生物数量分别进行隶属度计算。试验设计总酚、黄酮的权重取40，微生物的权重取20，经过计算得出的综合分数作为总指标进行直观分析。由表6可知，组合D3B2A2C1的综合分数最高。各因素对红茶菌发酵藜麦的影响程度依次为D＞B＞A＞C。由于表6中的试验6与直接分析结果一致，不需要做验证试验。因此最佳工艺为料水比14∶100 g/mL、接种量8%、温度25 ℃、加糖量6%，此条件下发酵液中总酚和黄酮质量浓度为0.652 mg/mL和0.233 mg/mL，乳酸菌、酵母菌、醋酸菌菌落数为6.811，6.511和7.863 lg CFU/g，微生物总量21.185 lg CFU/g。

表6 正交试验结果

试验号 A B C D结果 综合评分总酚质量浓度/(mg·mL-1) 黄酮质量浓度/(mg·mL-1) 微生物数量/(lg CFU·g-1) 总酚隶属度黄酮隶属度微生物隶属度综合分/分6 2 2 1 3 0.652 0.233 21.185 0.961 1.000 1.000 98.442 7 3 3 1 2 0.487 0.098 20.229 0.532 0.282 0.000 32.575 8 3 2 2 1 0.304 0.082 20.345 0.057 0.197 0.121 12.586 9 1 1 1 1 0.282 0.085 20.138 0.000 0.213 0.094 10.386 K1 39.4544.7547.1311.72 K2 52.4953.8738.9343.33 K3 40.7334.0546.6777.62极差R 13.0419.83 8.2065.90因素主次 D＞B＞A＞C最优组合 D3B2A2C1

3 结论

试验对原料藜麦进行不同处理，制备藜麦研磨液、水提液、磨浆液和糖化液，结果表明，研磨液为红茶菌发酵的最佳基质。在此基础上，确定出红茶菌发酵藜麦的最佳条件：料水比14∶100 g/mL，接种量8%，温度25 ℃，加糖量6%。该课题的研究结果一方面可丰富红茶菌发酵产品的种类，为相关食品的开发提供理论基础，另一方面可提高藜麦的利用和经济价值，对藜麦的深加工和开发利用有重要意义。