红茶菌和中草药红茶菌体外抑制沙门氏菌的比较研究

蒋小强，邱红辉，符乃方，蒋盛军* ，董志超，何际禅，阚 飙，闫梅英，梁未丽(.海南省东方市畜牧兽医局，海南东方57600;.中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所，海南儋州5777;.中国疾病预防控制中心传染病预防控制所，北京006)

红茶菌发酵液一般是利用红茶菌母液发酵茶叶、糖水溶液所发酵而成的生物活性菌液。由于红茶菌中含有醋酸菌、酵母和乳酸菌等生物活性菌，再加上茶叶提取物的作用，红茶菌发酵菌液一般对病原细菌都有较好的抑制作用。研究表明，红茶菌发酵液对大肠杆菌(Eschrichia coli)、宋内志贺氏菌(Shigella sonnei)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)等病原细菌［1－3］，但是该制剂对酵母菌粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、产阮假丝酵母(Candida utilis)、粘红酵母(Rhodotorula glutinis(Fres.)Harrison)和霉菌黑根霉(Rhizopus nigricans)、黄曲霉(Aspergillus.flavus)无抑制作用［4］。

中草药红茶菌是在红茶菌菌培养基的基础上，利用红茶菌中草提取液甘草、菊花、罗汉果、啤酒花等中草药提取液所获得新型红茶菌制剂，因为含有大量中草药提取液，所以新型红茶菌制剂被命名为中草药红茶菌制剂［5］。研究表明，中草药红茶菌制剂对口蹄疫病毒在体外和体外都有杀灭或抑制作用，对易感动物喷雾中草红茶菌可以有效预防口蹄疫的发生［6－7］。沙门氏菌是世界上造成食源性食物中毒最多的病原细菌。我国内陆地区也以沙门氏菌为首位。最近30年，由于人们生活水平的提高以及西餐的饮食方式的引进，鲜食蔬菜以及海鲜等水产品越来越容易导致沙门氏菌的感染，因此如何预防沙门氏菌的感染成为我国日常流行性细菌疾病预防与控制的重要研究课题之一。沙门氏菌的最适培养pH为6.5～7.5，属于喜欢偏中性以及弱碱性的病原菌。因此，能够产生大量有机酸以及耐酸性强的益生菌都能有效抑制或拮抗沙门氏菌。红茶菌包含自然界产酸性最强的醋酸菌，因此红茶菌能够有效抑制沙门氏菌［8－10］。为了研究红茶菌和中草药红茶菌对沙门氏菌的抑菌特性，笔者以沙门氏标准菌和临床分离沙门氏菌菌株为材料，研究红茶菌和中草药红茶菌对沙门氏菌的抑菌效果，旨在为临床上预防沙门氏菌的感染提供理论和技术支持。

1 材料与方法

1.1 供试中草药红茶菌制剂与菌种 红茶菌制剂和中草药红茶菌制剂为实验室自制［5－7］。鼠伤寒沙门氏菌标准株LT2(Salmonella enterica serovar Typhimurium LT2)［11］以及 20 个沙门氏菌临床分离株(Salmonella Typhi，编号分别为:4371、4373、42、1396、4369、1607、1449、4368、1220、1395、79、353、198、4367、1301、4374、1601、245、781、1430)。这些菌种都由中国疾病预防控制中心传染病预防控制所腹泻病室鉴定、保存和提供。

1.2 主要试剂和仪器

1.2.1 主要试剂。沙门氏菌显色培养基为法国科玛嘉沙门氏菌显色培养基，购自郑州博赛科技有限责任公司;MH肉汤、红茶菌制剂和中草药红茶菌制剂均为实验室自制［5－7］。红茶菌制剂和中草药红茶菌制剂使用一次性微孔滤膜过滤器过滤灭菌。

1.2.2 主要仪器。微量加液器、电子天平、37℃培养箱、振荡器。

1.3 方法

1.3.1 鼠伤寒沙门氏菌细菌培养。鼠伤寒沙门氏菌标准株LT2(Salmonella enterica serovar Typhimurium LT2)［11］以及 20个沙门氏菌临床分离株(Salmonella Typhi，编号分别为4371、4373、42、1396、4369、1607、1449、、4368，1220、1395、79、353、198、4367、1301、4374、1601、245、781、1430)分别接种到法国科玛嘉沙门氏菌显色培养基，然后挑单菌落接种到5 ml肉汤培养基中，振荡培养24 h。

1.3.2 致病菌悬液的制备。将肉汤培养基上培养的鼠伤寒沙门氏菌标准株LT2(Salmonella enterica serovar Typhimurium LT2)以及10个沙门氏菌临床分离株(Salmonella Typhi，编号分别为 4367、79、13、4374、4371、1091、1220、1396、4369、4373)分别置于生理盐水管中，充分混匀，校正浓度至0.5麦氏浊度(约1×108cfu/ml)和5.0麦氏浊度(1×109cfu/ml)。

1.3.3 试管稀释法测定微生态制剂对沙门氏菌的抑制浓度。每排放置6只2 ml的离心管，除每排第1支离心管外，每只离心管内加已高压灭菌的MH肉汤1 ml，每排的第1、2管分别加入2 ml受试物，依次对倍稀释至第7管，此时试管内红茶菌制剂或中草药红茶菌制剂浓度依次为1∶1、1∶2、1∶4和1∶8，第6管作为测试菌生长质控，然后每管加入3.6 μl 0.5麦氏浊度的测试菌液，使用振荡器混合均匀，在37℃培养箱中静止培养12 h后，取出1环接种沙门氏显色平板培养基，根据是否有病原菌生长来确定微生态制剂对测试菌的抑菌浓度.

1.3.4 共培养时间对红茶菌和中草药红茶菌体外抑制沙门氏菌的影响。每排安排5只2 ml的离心管，每只离心管内加1 ml红茶菌原液、红茶菌稀释液、中草药红茶菌原液和稀释液，然后每管加入3.6 μl 5.0麦氏浊度的测试菌液，用振荡器混合均匀，在37℃培养箱中静止培养1、2、4、8和12 h后，每小时取出1环接种沙门氏显色平板培养基，根据是否有病原菌生长来确定共培养时间对微生态制剂抑菌效果的影响。

1.3.5 红茶菌和中草药红茶菌原液对接种大剂量、高浓度沙门氏菌的体外抑制作用。为了探索通过口服红茶菌和中草药红茶菌预防沙门氏菌感染的可能性，每排安排6只2 ml的离心管，每只离心管内加入1 ml红茶菌原液、中草药红茶菌原液，然后每管加入20、50、125、250、500 和1 000 ml 5.0 麦氏浊度的测试菌液，用振荡器混合均匀，在37℃培养箱中静止培养12 h后，取出1环接种沙门氏显色平板培养基，根据是否有病原菌生长来确定微生态制剂的抑菌效果。

1.3.6 红茶菌原液和中草药红茶菌原液对接种大剂量、高浓度临床沙门氏菌的体外抑制作用。为了探索通过口服红茶菌和中草药红茶菌预防沙门氏菌感染的可能性，每排安排20只2 ml的离心管，每只离心管内加入1 ml红茶菌原液、中草药红茶菌原液，然后每管分别加入20个沙门氏菌临床菌株200 μl 5.0麦氏浊度的测试菌液，用振荡器混合均匀，在37℃培养箱中静止培养12 h后，取出1环接种沙门氏显色平板培养基，根据是否有病原菌生长来确定微生态制剂的抑菌效果。

2 结果与分析

2.1 过滤灭菌的中草药红茶菌对接种低浓度沙门氏菌的体外抑制作用 由表1可知，1 ml过滤红茶菌菌液，接种3.6 μl麦氏浊度0.50沙门氏标准株LT2菌液，培养12 h后只有过滤的红茶菌原液无沙门氏菌生长，其余处理包括对照大多有沙门氏菌生长;过滤的中草药红茶菌制剂的原液以及1∶1稀释的菌液能够完全抑制所接种的沙门氏菌的生长，1∶2稀释的过滤灭菌中草药红茶菌制剂的原液虽然不能完全抑制所接种的沙门氏菌的生长。这表明过滤灭菌的中草药红茶菌制剂原液以及1∶1倍稀释液都能够完全抑制所接种的低浓度的沙门氏菌，其余稀释液浓度不能完全杀灭低浓度的沙门氏菌;与红茶菌相比，过滤灭菌的中草药红茶菌的抑菌效果显著强于红茶菌。

表1 过滤灭菌红茶菌和中草药红茶菌对接种低浓度沙门氏菌的体外抑制作用

2.2 过滤灭菌红茶菌和中草药红茶菌对接种高浓度沙门氏菌的体外抑制作用 由表2可知，1 ml过滤灭菌的红茶菌菌液，接种3.6 μl(麦氏浊度 5.0)，培养 12 h 后只有过滤的原液中无沙门氏菌生长，其余处理包括对照大多有沙门氏菌生长;过滤灭菌的中草药红茶菌制剂的原液以及1∶1稀释的菌液能够抑制沙门氏菌的生长。这表明过滤灭菌的红茶菌制剂只有原液能够杀灭大量的高浓度的沙门氏菌，其余稀释液不能完全杀灭大量的高浓度的沙门氏菌。与过滤灭菌的红茶菌菌液相比，过滤灭菌的中草药红茶菌的抑菌效果显著强于红茶菌液。

表2 过滤灭菌红茶菌和中草药红茶菌对接种高浓度沙门氏菌的体外抑制作用

2.3 红茶菌和中草药红茶菌对接种低浓度沙门氏菌的体外抑制作用 由表3可知，红茶菌原液和稀释菌液，接种3.6 μl(麦氏浊度0.50)，培养12 h后只有过滤的原液无沙门氏菌生长，其余处理包括对照多有沙门氏菌生长;中草药红茶菌制剂的原液以及1∶1稀释的菌液能够抑制沙门氏菌的生长。这表明红茶菌只有原液能够杀灭大量的低浓度沙门氏菌，其余稀释液不能完全杀灭低浓度的沙门氏菌;与红茶菌相比，中草药红茶菌的抑菌效果显著强于红茶菌。

表3 红茶菌和中草药红茶菌对接种低浓度沙门氏菌的体外抑制作用

2.4 红茶菌和中草药红茶菌对接种高浓度沙门氏菌的体外抑制作用 由表4可知，1 ml红茶菌接种3.6 μl(麦氏浊度5.0)沙门氏菌，培养12 h后只有红茶菌原液无沙门氏菌生长，其余处理包括对照多有沙门氏菌生长;中草药红茶菌原液以及1∶1稀释的菌液能够抑制沙门氏菌的生长。这表明红茶菌制剂只有原液能够杀灭大量的高浓度的沙门氏菌，其余稀释液不能完全杀灭大量的高浓度的沙门氏菌;与红茶菌相比，中草药红茶菌的抑菌效果更强一些。

表4 红茶菌和中草药红茶菌对接种高浓度沙门氏菌的体外抑制作用

2.5 红茶菌和中草药红茶菌对接种大剂量、高浓度沙门氏菌的体外抑制作用 在上述研究的基础上，为了探索通过口服红茶菌和中草药红茶菌预防沙门氏菌感染的可能性，在红茶菌菌液乳酸菌制剂的原液中接种大剂量、高浓度鼠沙门氏菌LT2，观察乳酸菌制剂的原液对这些大剂量、高浓度的沙门氏菌的的体外拮抗作用。由表5可知，1 ml红茶菌原液最大可以拮抗250 μl高浓度的沙门氏菌(麦氏浊度5.0);1 ml中草药红茶菌原液最大可以拮抗1 000 μl高浓度的沙门氏菌，中草药红茶菌明显比红茶菌具有更强的抑制沙门氏菌的作用效果。

表5 红茶菌与中草药红茶菌原液对接种大剂量、高浓度沙门氏菌的体外拮抗作用

2.6 红茶菌和中草药红茶菌对临床分离沙门氏菌的抑制效果 为了进一步探索红茶菌和中草药红茶菌是不是对医院临床分离的沙门氏菌菌株有拮抗作用以及预防效果，利用从医院分离的20株临床沙门氏分离菌株为材料，培养这些菌液后将200 μl 5.0麦氏浊度的菌液接种到红茶菌和中草药红茶菌制剂原液中。由表6可知，1 ml红茶菌菌液仅对临床分离的3个菌种 245、781、1430的200 μl 5.0麦氏浊度的菌液具有完全的抑制作用，对其余的13个临床菌株菌液200 μl 5.0麦氏浊度的菌液没有完全的抑制作用;中草药红茶菌制剂的原液对这20个临床分离菌种200 μl 5.0麦氏浊度的菌液原液具有完全的抑制作用。这表明一些临床分离的沙门氏菌拮抗红茶菌和中草药红茶菌抑制作用的能力显著强于沙门氏菌的标准株LT2。但是，由于中草药红茶菌具有显著的抑菌作用，1 ml中草药红茶菌能完全抑制所有这20个临床分离沙门氏菌200 μl 5.0麦氏浊度的菌液。

表6 红茶菌对不同沙门氏杆菌菌株拮抗效果的比较

3 讨论

沙门氏菌是一种发达国家和发展中国家都普通流行的一种腹泻病原细菌。它也是一种人畜共患致病病菌。沙门氏菌感染可以引起人和动物的伤寒、副伤寒、胃肠炎和败血症等疾病，因此沙门氏菌的传染和爆发对人和动物的危害很大［12］。沙门氏菌为肠杆菌科沙门氏菌属成员，有约2 500多种血清型。通过使用沙门氏菌疫苗来预防众多血清型的病原菌难度很大。利用益生菌来预防沙门氏菌是其中最好的选择之一，乳酸菌、芽孢杆菌等益生菌都用于预防沙门氏菌的感染。虽然效果不错，但是在很多情况下这种效果又不显著，从而增加推广和应用的难度。此外，这些都是产酸性偏弱的益生菌。因此，如何预防沙门氏菌的感染在发达国家都是一个重要的难题。

该研究结果表明，1 ml红茶菌制剂和中草药红茶菌制剂都可以杀灭或抑制250 μl或1 000 μl高浓度的沙门氏菌。由于中草药红茶菌抑制沙门氏菌的能力约比红茶菌菌液强近4倍。

沙门氏菌是一种通过口服传染的病原体。对于身体虚弱的群体，少量的沙门氏菌感染(如15～20个菌)即可发病;成人的致病菌量需高达104～1010个以上。1 ml红茶菌制剂可以杀灭250×109cfu，相当于高致病剂量的2.5×106～25.0×106倍感染剂量;1 ml中草药红茶菌制剂预计可以杀灭1.0×1012个沙门氏菌，相当高致病剂量的1×107～1×109倍感染剂量。如此推理，口服200 ml红茶菌，200 ml红茶菌制剂可以杀灭4×1011个沙门氏菌，相当于400倍正常情况的感染剂量，相当于低感染剂量情况下4×109～4×1011倍感染剂量;同理，口服200 ml中草药红茶菌，200 ml中草药红茶菌制剂可以杀灭8×1011个沙门氏菌，相当于800倍正常情况的感染剂量，相当于特殊情况下8×109～8×1011倍感染剂量。因此，如果每次在食用高风险含沙门氏菌的海鲜或食品，口服200 ml红茶菌或中草药红茶菌菌液都能很好地预防沙门氏菌的感染。

为了控制由食用鸡蛋而导致的沙门氏菌食物中毒，我国食品专家利用我国的有关资料与信息建立了带壳鲜鸡蛋沙门氏菌定量危险性评估模型，对我国带壳鲜鸡蛋的沙门氏菌污染情况进行定量评估:消费前每个污染鸡蛋中的沙门氏菌菌量平均70 CFU［13］。通过对传统方法的改进，对采自皖南山区的80枚土鸡蛋样品进行了沙门氏菌，结果发现，蛋黄沙门氏菌感染率为2.5%，蛋清沙门氏菌感染率为5.0%。蛋壳表面沙门氏菌感染率为27.5%，沙门氏菌带菌数为1.22×103［14］。根据上述鸡蛋的带菌量，每次口服200 ml中草药红茶菌是可以杀灭这些沙门氏菌的。由此可见，鸡蛋中带有的沙门氏菌是一个很大的疾病感染源。由于我国很少有食用生鸡蛋的习惯，因此在食用鸡蛋导致的感染比较少见。然而，在美国等有食用生鸡蛋的国家，鸡蛋感染的沙门氏菌是一个很重要的致病菌来源。2010年美国发生由于鸡蛋沙门氏菌导致的人体感染，沙门氏菌爆发已经导致逾1 000人发病，召回被疑感染沙门氏菌鸡蛋的数量超过5亿枚。在澳大利亚，沙门氏菌平均每年导致11 992例感染［15］。一般而言，国外鸡蛋的沙门氏菌带菌量比国内的略少或相差不多，因此食用生鸡蛋的情况下，每次饮用100～200 ml中草药红茶菌菌液就可以杀灭这些病原菌，从而减少沙门氏菌感染的风险。

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