RNA干扰Livin基因联合顺铂对喉鳞状细胞癌Hep-2细胞增殖和凋亡的影响

李志勇, 冯 俊, 马 鹏, 彭 涛, 张欣平, 杨荃荃

(四川省南充市中心医院, 1. 耳鼻咽喉头颈外科, 2. 口腔科, 四川 南充, 637000)

喉癌为临床常见的头颈部恶性肿瘤，其中鳞状细胞癌最为常见(占95%以上)[1-2]。喉癌患者确诊时大多已为中晚期，手术结合放疗的效果并不理想，5年存活率仅20%～40%[3-4]。Livin基因是凋亡抑制蛋白(IAPs)家族成员，属于凋亡负向调控基因，与细胞凋亡及肿瘤发生发展密切相关，在多种恶性肿瘤中高表达且与肿瘤的复发、转移、预后存在一定关联[5-6]。目前，已有一些研究分析了Livin基因在喉鳞状细胞癌细胞中的表达及对预后的影响，但较少涉及细胞增殖与凋亡机制。恶性肿瘤的发生与细胞增殖失控和凋亡抑制有关，胃癌、肠癌、肾癌中Livin均与凋亡基因Bcl-2、Bax相关，但喉鳞状细胞癌中Livin是否与Bcl-2、Bax相关尚存争议[7]。此外，凋亡基因调控往往会引起细胞周期改变，这可能是Livin基因引起细胞分裂周期改变的机制。本研究探讨了RNA干扰技术下调Livin基因联合顺铂处理对喉鳞状细胞癌细胞系Hep-2细胞增殖和凋亡的影响，旨在为喉鳞状细胞癌Livin基因的深入研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

人喉鳞状细胞癌Hep-2细胞株1株，购自中科院上海细胞所。

1.2 仪器与试剂

Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡试剂盒(含Binding Buffer试剂)、噻唑蓝(MTT)试剂购自上海BestBio贝博生物有限公司。注射用顺铂(国药准字H20073653)，购自齐鲁制药有限公司。HAJ3270恒温CO2细胞培养箱，购自上海新诺公司。Annexin流式细胞仪，购自美国贝克曼库尔特有限公司。伯乐PCR基因扩增仪，购自美国BioRad公司。

1.3 方法

1.3.1 细胞培养与分组: 将人喉鳞状细胞癌Hep-2细胞株的冻存管从液氮中取出，置于RPMI1640培养基上，于37 ℃恒温、5% CO2细胞培养箱中进行细胞培养。取对数生长期细胞，接种于24孔板专用细胞玻片，进行脂质体转染。RNA干扰转染Livin基因所用的序列: 上游引物5′-GGGACCACGUGGAUGGGC-3′, 下游引物5′-UGCCCAUCCACGUGGUCC-3′。转染后，需要经蛋白免疫印迹法证实是否转染成功(Livin表达下调表示转染成功)，经荧光显微镜观察转染率。采用简单随机分组法将细胞分为阴性对照组(细胞未经任何处理)、干扰组(细胞经RNA干扰Livin转染)、顺铂组(细胞经6 μmol/L顺铂处理)、联合组(细胞经RNA干扰Livin转染+6 μmol/L顺铂处理)，每组均设置6个复孔，另设置无细胞的培养液作为空白孔调零。

1.3.2 细胞增殖抑制率检测: 采用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(MTT法)检测各组细胞增殖抑制率。分组处理48 h后，收集对数生长期细胞，调整细胞悬液浓度至5×104个/mL, 37 ℃恒温、5% CO2条件下孵育。当细胞单层铺满96孔平底板后，每孔滴加0.5% MTT试剂20 μL, 37 ℃恒温、5% CO2细胞培养箱孵育4 h, 终止培养; 然后向每孔加入二甲基亚砜试剂150 μL, 轻轻震荡10 min; 最后使用Varioskan LUX酶标仪，于570 nm处测量光密度(OD)值。细胞增殖抑制率=[1-(实验孔OD-空白孔OD)/(对照孔OD-空白孔OD)]×100%。

1.3.3 细胞凋亡和细胞周期检测: 采用流式细胞仪Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡率和细胞周期分布。分组处理48 h后，调整细胞浓度至1×106个/mL。加入20 μg/mL浓度Annexin V-FITC试剂10 μL，37 ℃避光孵育30 min; 再加入50 μg/mL浓度PI试剂5 μL, 37 ℃ 避光孵育 5 min; 最后加入Binding Buffer试剂400 μL, 37 ℃避光孵育5 min。阴性对照为不加Annexin V-FITC/PI试剂的细胞孔。使用流式细胞仪PI染色法对细胞内DNA含量进行检测，将细胞周期各时相区分为G1/G0期、S期和G2/M期，通过CELLQuest软件计算流式直方图对应的细胞周期各时相细胞的百分率。

1.3.4 细胞Bcl-2mRNA、BaxmRNA检测: 采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测。分组处理48 h后，细胞经超声波细胞破碎仪破碎，再加入0.25%胰蛋白酶消化细胞, 10 000转/min离心弃上清，加入Trizol试剂抽提细胞总RNA，干燥RNA沉淀物, -20 ℃保存待检。引物设计由生工生物工程(上海)有限公司负责,Bcl-2mRNA上游引物5′-CCTTTGTGTAACTGTACGGCC-3′, 下游引物5′-CTTTGGCAGTAAATAGCTGATTCGAC-3′;BaxmRNA上游引物5′-GGATGCGTCCACCAAGAA-3′, 下游引物5′-TCCCGGAGGAAGTCCATT-3′; β-actin为内参。反应条件为94 ℃ 5 min, 94 ℃ 40 s, 60 ℃ 40 s, 72 ℃ 15 s循环30次, 72 ℃延伸10 min, 最后4 ℃冷却结束; 扩增完毕后进行凝胶电泳。

1.4 统计学分析

2 结 果

2.1 喉鳞状细胞癌Hep-2细胞经RNA干扰Livin转染结果

喉鳞状细胞癌Hep-2细胞经RNA干扰后,Livin表达显著下调，见图1。荧光显微镜观察结果显示, 24、48、72 h的绿色荧光密度分别为(51.13±15.22)%、(72.17±10.26)%、(76.30±12.48)%, 48、72 h的绿色荧光密度显著高于24 h, 并呈时间依赖性，见图2。采用流式细胞术检测细胞转染率发现，与48 h相比, 72 h细胞死亡较多，不利于后续实验，故本研究选择48 h为最佳转染时间，见图3。

2.2 各组细胞增殖与凋亡情况比较

干扰组、顺铂组、联合组的细胞增殖抑制率、细胞凋亡率均高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05); 联合组的细胞增殖抑制率、细胞凋亡率均高于干扰组、顺铂组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。流式细胞仪Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡的流式荧光图见图4，各组细胞增殖抑制率、细胞凋亡率比较的柱状图见图5。Annexin V-FITC/PI染色可见，联合组细胞核破裂及凋亡小体形成，见图6。

表1 各组细胞增殖与凋亡情况比较 %

A: Hep-2细胞Livin表达的蛋白免疫印迹图(N为阴性对照, T为RNA干扰Livin的Hep-2细胞株, β-actin为内参); B: Livin表达量的柱状图(与N比较, ∗P<0.05)。图1 喉鳞状细胞癌Hep-2细胞Livin表达的蛋白免疫印迹图及表达量柱状图

图2 荧光显微镜观察转染效率(放大倍数100倍)

图3 24、48、72 h细胞转染率的流式细胞术检测结果

图4 流式细胞术检测各组细胞凋亡的流式荧光图

A: 各组细胞增殖抑制率柱状图; B: 各组细胞凋亡率柱状图。与对照组比较, ∗P<0.05; 与联合组比较, #P<0.05。图5 各组细胞增殖抑制率、细胞凋亡率比较

图6 Annexin V-FITC/PI染色显示细胞核形态改变(放大倍数400倍,箭头处为细胞核破裂及凋亡小体形成)

2.3 各组细胞周期分布情况比较

干扰组、顺铂组、联合组的G0/G1期细胞占比均高于对照组, S期和G2/M期细胞占比均低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05); 联合组G0/G1期细胞占比高于干扰组、顺铂组, S期和G2/M期细胞占比低于干扰组、顺铂组，差异有统计学意义(P<0.05), 见表2。

表2 各组细胞周期分布情况比较 %

2.4 各组细胞Bcl-2 mRNA、Bax mRNA水平比较

干扰组、顺铂组、联合组的Bcl-2mRNA水平低于对照组，BaxmRNA水平高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05); 联合组Bcl-2mRNA水平低于干扰组、顺铂组，BaxmRNA水平高于干扰组、顺铂组，差异有统计学意义(P<0.05), 见表3。各组细胞Bcl-2mRNA、BaxmRNA表达水平柱状图见图7, RT-PCR电泳图见图8。

表3 各组细胞Bcl-2 mRNA、Bax mRNA水平比较 ×10-3

A: 各组细胞Bcl-2 mRNA柱状图; B: 各组细胞Bax mRNA柱状图。与对照组比较, ∗P<0.05; 与联合组比较, #P<0.05。图7 各组细胞Bcl-2 mRNA、Bax mRNA表达水平比较

A: Bcl-2 mRNA的RT-PCR电泳图; B: Bax mRNA的RT-PCR电泳图。1、2、3、4分别表示对照组、干扰组、顺铂组、联合组。图8 各组细胞Bcl-2 mRNA、Bax mRNA的RT-PCR电泳图

3 讨 论

基因靶向治疗应用前景广阔，有望成为喉鳞状细胞癌治疗的新方向，因此寻找喉鳞状细胞癌凋亡相关基因十分重要。Livin基因是21世纪新发现的凋亡抑制基因，可调控凋亡抑制蛋白的表达，发挥抗细胞凋亡的作用，主要机制是通过Caspase蛋白酶激活级联反应途径、激酶活性调节H2A. XY142磷酸化通路抑制细胞凋亡[8-9]。Livin基因在骨肉瘤[10]、非小细胞肺癌[11]、胃癌[12]、腮腺瘤[13]等多种恶性肿瘤中高表达，且与肿瘤的复发、转移、预后生存有一定关联。相关研究[14-15]显示,Livin基因沉默靶向诱导恶性肿瘤细胞凋亡，故Livin可作为免疫介导肿瘤凋亡的靶点。研究[16]报道，喉鳞状细胞癌组织中Livin表达阳性率为71.26%, 显著高于癌旁喉组织，且阳性率与临床分期、淋巴结转移等呈正相关，说明分析Livin对于探讨喉鳞状细胞癌的凋亡机制具有重要价值。

尽管目前尚未检索到关于RNA干扰Livin对喉鳞状细胞癌细胞系Hep-2细胞增殖和凋亡影响的相关研究，但参考肺腺癌SPC-A1细胞[17]、子宫内膜癌HEC-1-A细胞[18]采取RNA干扰Livin联合顺铂处理的类似研究，发现RNA干扰Livin可促进癌细胞凋亡。本研究结果显示，对照组细胞凋亡率超过10%，比率稍高，这可能与细胞培养时消化时间稍长有关。本研究还发现，干扰组、顺铂组、联合组喉鳞状细胞癌Hep-2细胞的增殖抑制率和凋亡率均显著高于对照组，且联合组细胞增殖抑制率和凋亡率显著高于干扰组、顺铂组。由此证明: ① 敲低Livin表达可抑制喉鳞状细胞癌细胞增殖，促进细胞凋亡; ② RNA干扰Livin联合顺铂化疗具有协同作用，可增强肿瘤细胞对化疗药物顺铂的敏感性，加强细胞增殖抑制，促进细胞凋亡，这为喉鳞状细胞癌Livin基因靶向治疗提供了思路。

进一步研究发现, RNA干扰Livin联合顺铂处理后，细胞分裂周期变化显著, G0/G1期细胞占比升高, S期和G2/M期细胞占比下降。由此说明，下调Livin延长了G0/G1期，具体表现为细胞合成RNA和核糖体时间延长，未能快速进入增殖期，表现为细胞增殖受阻，此外细胞DNA复制和有丝分裂时间减少，同样说明细胞增殖受阻。这种细胞分裂周期的变化可能是RNA干扰Livin的机制之一，最终导致细胞增殖减少。为进一步阐明Livin表达下调介导细胞凋亡的分子机制，本研究分析了Bcl-2mRNA和BaxmRNA水平，发现RNA干扰Livin联合顺铂处理后Bcl-2mRNA水平呈下调趋势，BaxmRNA水平呈上调趋势。Bax基因属于细胞凋亡促进基因,Bax表达上调可拮抗Bcl-2, 促进细胞凋亡[19]。由此说明,Livin表达下调与Bcl-2和Bax基因表达具有内在联系。结直肠癌相关研究[20-21]发现,Livin与凋亡相关蛋白Bcl-2的异常表达有关，本研究发现喉鳞状细胞癌Livin表达下调与Bcl-2和Bax基因表达具有关联，在一定程度上验证了Livin的抗凋亡作用。

综上所述, RNA干扰Livin联合顺铂处理喉鳞状细胞癌Hep-2细胞，可抑制细胞增殖并促进细胞凋亡。