微小RNA-126和血管内皮生长因子在增殖性糖尿病视网膜病变患者视网膜前膜中的表达及意义

李 瑞, 李万明, 陈小丽

(1. 北京航天总医院 眼科, 北京, 100076; 2. 首都医科大学附属北京地坛医院 眼科, 北京, 100076)

增殖性糖尿病视网膜病变(PDR)是2型糖尿病患者常见的一种微血管病变，主要是由于长期慢性高血糖引发视网膜缺血，诱发新生血管异常生长及继发性纤维组织增殖，进而促使视网膜前膜的异常增殖及纤维化，最终导致血管源性病变[1]。PDR的发病机制目前尚未完全清楚，且患者发病初期症状不明显，故寻求PDR发生过程中的关键靶标基因具有重要意义。微小RNA(miRNAs)是一类长度为20～25个核苷酸的高度保守的内源性非编码单链小RNA分子，可参与细胞增殖分化、免疫反应等多种生理及病理过程并发挥重要作用[2-4]。血管内皮生长因子(VEGF)具有诱导血管生成的作用，其高表达与PDR形成有关[5]。相关研究[6]表明，微小RNA-126(miR-126)可通过调控靶基因VEGF的表达而发挥调节血管生成的功能，且可促进新生血管的形成。本研究主要探讨miR-126、VEGF在PDR患者视网膜前膜组织中的表达变化并分析其临床意义，现将结果报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2018年3月—2020年2月于北京航天总医院眼科择期行玻璃体切割手术的PDR患者65例纳入研究组，另选取同期行玻璃体切割手术的特发性黄斑裂孔患者62例纳入对照组。研究组中，男41例，女24例，年龄41～71岁，平均(56.12±9.33)岁，糖尿病病程为5～15年，平均(10.12±1.65)年。对照组男34例，女28例，年龄42～70岁，平均(57.03±9.52)岁。研究组纳入标准: ① 符合PDR相关诊断标准[7]者; ② 反复出现玻璃体积血者; ③ 检查出眼底出现增生膜或牵拉性视网膜脱离者; ④ 既往无眼部手术史者。对照组纳入标准: 符合特发性黄斑裂孔的诊断标准且未合并其他眼部疾病者。排除标准: ① 患有其他眼部疾病者; ② 患有血液系统疾病或代谢性疾病者; ③ 合并严重高血压者; ④ 近期接受抗新生血管药物治疗者; ⑤ 合并恶性肿瘤及免疫系统疾病者。2组患者一般资料比较，差异无统计学意义(P>0.05), 具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 标本采集[8]: 2组患者均接受常规玻璃体切割术治疗。灌注前使用玻璃体切割头抽取玻璃体液0.6 mL置于微量离心管中，手术中留取视网膜前膜组织，并转移至-80 ℃冰箱保存备用，术中使用0.06%台盼蓝溶液帮助视网膜前膜组织的完整剥除。

1.2.2 实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)法检测视网膜前膜组织中miR-126、VEGFmRNA表达水平: 取出冻存的视网膜前膜组织，加入细胞裂解液进行裂解，按照Trizol试剂盒(北京天根生化科技有限公司)操作步骤提取总RNA。采用miRNAs反转录试剂盒(北京天根生化科技有限公司)说明书将RNA反转录为cDNA。采用聚合酶链反应(PCR)试剂盒(美国Invitmgen公司)进行qRT-PCR反应并检测miR-126、VEGFmRNA的相对表达量，反应体系为20 μL(2×SYBR Mix 10 μL, 10×cDNA模板1 μL, 上下游引物各1 μL, H20 8 μL), 反应程序设定为94 ℃预变性1 min, 92 ℃ 30 s, 60 ℃ 30 s, 75 ℃ 30 s, 共40个循环，每个样本设置3个平行反应复孔。在PCR仪上(Bio-Red公司)进行反应，其中引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，见表1。反应结束后对数据进行分析，其中miR-126以U6作为内参，按照2-△△Ct算法进行基因相对定量表达分析,VEGFmRNA以β-actin为内参，按照2-△△Ct算法计算基因相对表达量。

表1 qRT-PCR引物序列

1.2.3 Western blotting法检测VEGF蛋白表达水平: 取2组视网膜前膜组织在冰上剪成碎片并用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤，简单离心后弃去PBS并加入蛋白裂解液，采用玻璃匀浆器匀浆至组织破碎，并在冰上裂解30 min, 简单离心5 min后将上清转移至另一EP管中即组织总蛋白产物，采用二辛可宁酸法检测蛋白纯度并取20 μg蛋白样品于沸水中煮5 min, 之后进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳并电转移至聚偏二氟乙烯膜。封闭液封闭并加入一抗兔抗鼠VEGF多克隆抗体(1∶2 000), 室温下静置120 min, 清洗后加入二抗室温孵育60 min, 再次清洗。采用电化学发光法试剂盒发光显影并运用Quantity One(美国BIO-RAD公司)分析软件对条带灰度值进行分析，以β-actin为内参对显影条带进行VEG蛋白相对表达量的计算。

1.3 观察指标

检测并比较2组患者的空腹血糖(FBG)、糖化血红蛋白(HbA1c)、甘油三酯(TG)水平。2组患者检查前1 d晚8时后禁食且不可剧烈运动，次日抽取空腹静脉血检测。首先检测FBG水平，之后进行抗凝实验，采用高压液相法以Sysmex全自动生化分析仪(日本希森美康公司)及其配套试剂检测HbA1c水平，将采集的血样离心20 min取上清，检测TG水平。

1.4 统计学分析

2 结 果

2.1 视网膜前膜组织中miR-126、VEGF mRNA及蛋白表达水平比较

研究组患者视网膜前膜组织中miR-126表达水平低于对照组,VEGFmRNA及其蛋白表达水平高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2、图1。

表2 2组视网膜前膜组织中miR-126、VEGF mRNA和VEGF蛋白表达水平比较

图1 VEGF蛋白条带图

2.2 FGB、TG及HbA1c水平比较

研究组患者FGB、TG、HbA1c水平均高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

2.3 研究组患者miR-126与VEGF mRNA的相关性及两者与FGB、HbA1c、TG的相关性分析

Pearson相关分析法结果显示，研究组患者视网膜前膜组织中miR-126表达水平与VEGFmRNA表达水平呈显著负相关(P<0.05), 见图2; miR-126与FGB、HbA1c、TG呈显著负相关(P<0.05), 而VEGFmRNA与FGB、HbA1c、TG呈显著正相关(P<0.05), 见表4。

表3 2组FGB、TG及HbA1c水平比较

图2 miR-126与VEGF mRNA表达水平的相关性分析

2.4 PDR的单因素与多因素Logistic回归分析

单因素Logistic分析显示, FGB、HbA1c、TG、miR-126、VEGFmRNA表达水平为PDR发生的影响因素; 多因素Logistic分析显示, miR-126、VEGFmRNA表达水平为PDR发生的独立影响因素。见表5、表6。

表4 miR-126、VEGF mRNA与患者临床指标的相关性分析

表5 PDR影响因素的Logistic单因素分析

表6 PDR影响因素的Logistic多因素分析

3 讨 论

PDR发生机制较为复杂，可能与体内炎症反应、慢性缺血缺氧、自由基生成、蛋白质的非酶糖基化、氧化应激反应等多种病理过程有关[9]。持续高血糖会引起血管障碍并促使视网膜血管阻塞，造成基底膜增厚而导致视网膜无灌注区缺血缺氧状态，这一病理过程会破坏血管生成抑制因子与刺激因子的平衡并刺激新生血管生成[10]。研究[11]表明，糖尿病视网膜病变患者血清VEGF水平升高，且VEGF水平与病变严重程度有关。miR-126与肿瘤组织中微血管生成相关，且可通过抑制血管内皮生长因子A表达而抑制乳腺癌细胞的增殖及迁移[12]。miR-126、VEGF表达与PDR发生、发展的关系目前尚未完全明确，本研究检测患者视网膜前膜组织中miR-126、VEGF表达水平，旨在分析其与视网膜病变的关系及临床意义。

miR-126位于表皮生长因子结构域7的内含子6与7区域内，定位于人9号染色体，可通过诱导靶基因表达而调控信号转导通路并在内皮细胞中发挥其生物学功能[13]。施凤涟等[14]报道，妊娠期糖尿病患者血清miR-126表达水平较血糖正常的妊娠者低，且其低表达与胰岛素抵抗有关。相关研究[15]发现，缺氧性视网膜病变模型动物的视网膜血管内皮细胞中miR-126过表达可抑制新生血管形成，且miR-126可维持血管完整性并参与视网膜病变过程。由此推测, miR-126可能参与PDR过程。本研究结果显示，研究组患者视网膜前膜组织中miR-126表达水平显著低于对照组，说明PDR患者视网膜前膜组织中miR-126呈低表达，且参与PDR的发生发展过程。相关研究[16]发现, FGB、HbA1c等指标与糖尿病视网膜病变的病理过程紧密相关，且与疾病严重程度有关，即病情越严重其水平越高。本研究结果显示，研究组患者HbA1c、TG水平显著高于对照组，与相关研究[17]结论一致。本研究还分析了PDR患者FGB、HbA1c、TG水平与miR-126表达水平的相关性，结果显示miR-126分别与FGB、HbA1c、TG呈显著负相关，说明miR-126不仅参与PDR病理过程，还与疾病严重程度紧密相关。

VEGF位于人染色体6p21.3, 可通过其特异性受体活化磷脂酶C并增加钙离子内流而提高磷酸肌醇水平，进而促使内皮细胞增殖，有利于血管生成[18]。研究[19]表明, VEGF在多种恶性肿瘤中发挥重要功能，不仅可产生促血管生长细胞因子，还能诱导肿瘤血管生长或加快病变血管内皮细胞的增殖及迁移。相关研究[20]发现，血清VEGF水平升高参与老年糖尿病视网膜病变的发生，且VEGF水平升高可作为评价患者微血管损伤的依据。本研究结果显示，研究组患者视网膜前膜组织中VEGFmRNA及其蛋白表达水平均显著高于对照组，说明VEGF与PDR发展及新生血管形成关系密切。由此推测, VEGF可通过增加血管的通透性与视网膜局部新生血管的形成而参与糖尿病患者发生PDR的过程。本研究相关性分析结果显示,VEGFmRNA与FGB、HbA1c、TG均呈显著正相关，说明VEGF除可引起糖尿病患者发生PDR外，还与病变严重程度紧密相关。本研究结果还显示, miR-126与VEGFmRNA呈显著负相关，推测PDR患者持续高血糖不仅可直接损害视网膜血管，还可引起视网膜组织慢性缺血缺氧导致miR-126表达下调并上调VEGF，进而参与病变过程。本研究多因素Logistic回归分析结果显示, miR-126、VEGFmRNA表达水平均是糖尿病患者发生PDR的影响因素。由此提示, miR-126低表达可诱导VEGF高表达而改变PDR患者眼部正常组织结构及功能，并进一步促进病情恶化, miR-126、VEGF均可参与PDR的发生发展。

综上所述, PDR患者视网膜前膜组织中miR-126表达下调,VEGFmRNA表达上调，两者呈显著负相关且共同参与疾病的发生发展。检测患者miR-126、VEGFmRNA和其蛋白表达水平，有助于及时诊治，进而防止病情恶化。本研究存在不足之处，如未检测血清和玻璃体中miR-126、VEGF表达水平，也未探讨miR-126与VEGF在PDR发生过程中的具体调控机制，有待未来进一步深入研究加以探讨。