羌活-独活治疗膝骨关节炎的作用机制

吴鹏 时孝晴 廖太阳 王培民 张农山 黄正泉 丁亮 邢润麟 茆军

南京中医药大学附属医院，江苏 南京210029

膝骨关节炎(knee osteoarthritis, KOA)是一种以膝关节疼痛、活动受限、僵硬甚至畸形为主要症状的慢性退行性骨关节疾病[1]。患者年轻化、发病率逐渐上升，使KOA已成为全球范围内的公共卫生问题[2]。目前，无论是药物还是手术治疗均具有一定局限性，中医药在KOA的治疗上历史悠久、副作用较少、疗效确切[3]。羌活-独活二者经常被用于风寒湿引起的关节疼痛、风湿骨病[4]。羌活辛、苦，性温，辛温解表、散寒止痛、通利关节，为治疗风寒湿痹之要药，独活辛、苦、微温，祛风除湿、疏经通络、通痹止痛，能散在里之伏风，二者一上一下，一表一里，相须为用。二者作为药对出现最早记载于《外台秘要》：羌活行上焦而理上……独活行下焦而理下……二者配伍，直通上下，横行肢臂、腰膝、治各类风寒湿痹皆可[5]。但中药成分复杂，具体作用机制还需进一步研究，借助现代网络药理学，探讨羌活-独活药对治疗膝骨关节炎的作用机制，为其治疗KOA提供有力的理论支撑，有助于中医药的现代化。

网络药理学通过分析药物、基因和蛋白的相互作用，发现其相互作用网络，这与中医药的“整体观、系统观”十分契合[6-8]，目前，网络药理学已被广泛运用于中药药理机制研究、药物重新定位、毒副作用等相关研究[9-11]。本研究拟通过网络药理学，探讨羌活-独活治疗KOA的潜在作用靶标和信号通路，为羌活-独活治疗KOA提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 筛选羌活-独活活性成分

通过中药系统药理学数据库和分析平台(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform, TCMSP)以“羌活，独活”为关键词检索所有化合物活性成分信息，筛选条件：药物口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥ 30%，药物相似性(drug-likeness，DL)≥ 0.18，筛选出羌活-独活活性成分[12-14]。

1.2 筛选羌活-独活和KOA相关靶点

通过GeneCard、OMIM、PharmGkb、Therapeutic Targets和DrugBank 数据库，以“Knee osteoarthritis”为关键词，检索与KOA相关的基因，通过Uniprot数据库(https://www.uniprot.org/uniprot/)将上述获得的羌活-独活作用靶标转化为对应的基因名称，再将羌活-独活活性成分的靶点预测结果与检索出的KOA相关靶标进行匹配，筛选交集靶点，确定羌活-独活治疗KOA的核心靶点，通过Venny2.1.0(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)绘制韦恩图。

1.3 构建羌活-独活活性成分与KOA作用靶点网络

将筛选出的12个羌活-独活活性成分和16个KOA的相关靶点导入Cytoscape 3.8.0软件构建羌活-独活活性成分与KOA靶点网络[15]。

1.4 构建蛋白互作网络(PPI)及筛选核心基因

将上述羌活-独活的蛋白靶点导入String数据库(https://string-db.org/)，设置物种：Homo sapiens，置信度：0.4，绘制PPI网络，通过拓扑分析筛选关键靶点，使用R project软件制作显示基因名和与其相连节点数的条形图。

1.5 GO和KEGG富集分析

使用RGUI和org.Hs.eg.db将所得到的羌活-独活治疗KOA潜在靶点转化为entrezID后再使用RGUI、DOSE和ClusterProfiler对相关靶点进行GO和KEGG富集分析。选择富集程度最高的前20条通路。

1.6 分子对接

使用Discovery Studio 2016 3.0对羌活-独活活性成分与3个KOA核心靶点通过分子对接进行间接验证。羌活-独活类药成分与KOA作用靶点分别通过Chemical Book数据库和PCSB PDB数据库获取。将上述获得的靶蛋白进行去水、加氢等处理，保存为对接受体。使用LibDock模块进行分子对接，保存各图像。通过LibDock score结果评价活性成分和关键靶点之间的对接效应，LibDock score 分数越高表明配体与受体蛋白结合性越好。

2 结果

2.1 羌活-独活活性成分

在TCMSP数据库中根据OB≥ 30%，DL≥ 0.18的原则下筛选出羌活-独活15种活性成分，最终纳入12个有效活性成分，详见表1。

2.2 羌活-独活活性成分与KOA作用靶点的构建

通过TCMSP平台筛选出羌活-独活中分成35个有效活性成分作用靶标，在GeneCard、OMIM、PharmGkb、Therapeutic Targets和DrugBank 数据库中检索到1 952个与KOA相关靶点，映射后得到16个共同靶基因，韦恩图见图1，羌活-独活活性成分靶标见表2。

表1 TCMSP中筛选羌活-独活的活性成分

图1 羌活-独活成分与KOA靶点韦恩图Fig.1 Venn map of ingredient of ligustrilucidi-Notopterygium incisum-Angelica pubescens-KOA

表2 羌活独活治疗KOA潜在靶点信息

图3 羌活-独活治疗KOA潜在核心靶点Fig.3 Potential core targets for Notopterygium incisum-Angelica pubescenstreating KOA

2.3 羌活-独活活性成分与KOA靶点网络的构建

将12种活性成分与16个KOA相关作用靶点进行映射后导入Cytoscape 3.8.0构建羌活-独活成分-KOA靶点网络，见图2。

图2 羌活-独活成分-KOA靶点网络Fig.2 Ingredient of Notopterygium incisum-Angelica pubescens-target network of KOA注：蓝色长方形：中药名称；红色菱形：疾病名称；黄色椭圆形：药物有效成分；绿色椭圆形：疾病作用靶标。

2.4 核心靶点筛选

将16个关键靶标导入STRING数据库，PPI网络显示其中16个节点，43条边，将TSV数据导入Cytoscape，基于度中心性(degree centrality，DC)、介数中心度(betweenness centrality，BC)、接近中心性(closeness centrality，CC)使用CytoNCA对上述数据进行分析，删除2个孤立点，对剩下的14个节点进行第1次筛选，DC≥ 6.000，BC≥ 0.619，CC≥ 2.767，网络显示共有5个节点，10条边，再对这5个节点进行第2次筛选，DC≥ 9.000，BC≥ 0.765，CC≥ 21.867，网络显示共有3个节点，3条边，最终得到的JUN、PTGS2、CASP3为核心靶点，见图3。

2.5 GO和KEGG通路富集分析

GO分析显示羌活-独活能够参与核受体的活动、配体激活的转录因子活性等相关过程，见图4。KEGG富集分析显示主要与细胞凋亡、雌激素、P53、IL-17、AGE-RAGE等信号通路密切相关，见图5。

图4 羌活-独活活性成分潜在治疗KOA靶点的GO功能分析Fig.4 GO biological process enrichment analysis of Notopterygium incisum-Angelica pubescens against KOA

图5 羌活-独活活性成分潜在治疗KOA靶点的KEGG富集分析Fig.5 KEGG signaling pathway of Notopterygium incisum-Angelica pubescens against KOA

2.6 分子对接分析

分子对接结果显示，羌活-独活活性成分与筛选出的JUN、PTGS2、CASP3均能较好对接，与网络药理学筛选结果相吻合，间接验证了羌活-独活能够调节KOA的核心靶点。配对结果见表3，部分对接过程见图6。

3 讨论

KOA作为一种慢性、高致残性疾病，给患者及社会带了沉重的经济负担，现已成为医学领域亟待解决的公共健康问题。疼痛是KOA最常见的症状，超过65 %的KOA患者以疼痛为最主要表现。多数就诊的KOA患者表示疼痛是影响其生活质量的重要原因，控制疼痛是其最主要的就诊目的[16]。对症状性的KOA患者，口服或局部使用非甾体类抗炎药或曲马多是常见的诊疗手段[17]。但不可否认的是，尽管西药的运用获得了一定的成效，但远期临床疗效仍难尽人意。与此同时，非甾体类抗炎药在治疗

表3 配体受体蛋白分子对接情况Table 3 Molecular docking of Ligand receptor protein

图6 羌活-独活活性成分和KOA靶点beta-sitosterol对接过程Fig.6 The docking process of active ingredient of Notopterygium incisum-Angelica pubescens with beta-sitosterol of KOA targets注：a～c依次为CASP3、JUN、PTGS2与beta-sitosterol对接过程。

KOA的同时，还会引起胃肠道及心血管等方面的副作用[18-19]。

在祖国医学中，KOA属于“痹症”范畴，《素问·痹症》记载到：风寒湿三气杂至，合而为痹也”，大多数KOA患者为老年人，年老体弱，肝肾不足，气虚亏虚，不足以濡养经脉，再加上风、寒、湿三邪入侵，寒湿凝滞，气血淤阻，不通则痛[20]。中医药具有多通路、多靶点、多途径的作用特点，对复杂性疾病往往能更好的发挥治疗作用。网络药理学作为一种药物研究策略，在中医药的研究中已得到广泛应用，有利于我们更好的了解药物及其化合物的作用[21]。此外，分子对接有助于揭示药物与靶点之间的关系。

羌活-独活对KOA的治疗疗效显著，然而分子层面的相关研究相对缺乏。因此，在本研究中，结合拓扑分析和分子对接策略，通过构建和分析目标网络，对目标进行富集分析，揭示潜在机制。本研究筛选出了羌活-独活的12个活性成分和16个防治KOA的作用靶点。有研究[22]显示，羌活-独活联用较单味药能更减缓佐剂关节炎大鼠的足趾肿胀，提高机械刺激疼痛阈值，抑制炎症因子的分泌。其中欧前胡素抗炎镇痛作用已得到广泛研究[23-25]。异欧前胡素能够抑制脂多糖刺激的RAW264.74小鼠巨噬细胞NO的释放[26]。佛手柑内酯对大鼠成骨细胞的增殖和分化具有促进作用[27]。香叶木素可以改善KOA软骨细胞变形，增加软骨细胞数量，能够缓解软骨细胞凋亡和免疫反应[28]。由此可见羌活-独活能够多通路、多靶点治疗KOA。

富集分析显示，羌活-独活能够参与半胱氨酸型内啡肽酶活性参与凋亡过程，核受体的活动、配体激活的转录因子活性、类固醇激素受体活性等相关通路，与细胞的增殖、凋亡和调控细胞代谢密切相关。KEGG富集分析显示相关通路主要包括细胞凋亡、雌激素、P53、IL-17、AGE-RAGE等信号通路。CASP3、CASP8、CASP9和PTGS2都是与凋亡密切相关的蛋白酶，CASP3不仅能够激活CASP6、CASP7和CASP9，还能调控细胞的迁移、侵袭，在KOA中与软骨的退变和软骨细胞凋亡关系密切[29-31]。BAX主要位于细胞质，能够释放下游凋亡因子，当BAX过表达会抑制BCL-2的活性，促进细胞凋亡[32-33]。JUN是激活蛋白1的亚单位之一，JNK受刺激后能促进JUN磷酸化，扩大炎症反应[34]。AR是一种配体依赖性反转录调节蛋白，雄激素能够通过AR干预细胞免疫和细胞因子起到抗炎作用[35-36]。ESR1是一种配体依赖的转录因子，常表达于软骨细胞、破骨细胞、成骨细胞以及骨髓基质细胞等，雌二醇靶向ESR1能够抑制ERK信号通路，激活自噬，抑制凋亡，调控软骨细胞增殖[37]。正常软骨中没有NOS2表达，当NOS2受到相关刺激则能升高NO，增加对软骨的破坏[38]。

综上，本研究运用网络药理学的方法，对“羌活-独活”治疗KOA的作用机制进行了探究，同时通过分子对接将核心靶点与关键成分进行对接验证，间接证实了本研究的准确性和可靠性。通过分析，筛选出羌活-独活12种活性成分和16个潜在作用靶点，初步推测羌活-独活可能通过欧前胡素、异欧前胡素、佛手柑内酯、香叶木素、谷甾醇等有效活性成分调控CASP3、JUN、CASP8、AR等靶点调节细胞凋亡、雌激素、P53、IL-17、AGE-RAGE等信号通路，抑制炎症，干预细胞凋亡过程，从而起到治疗KOA的作用。本研究初步阐释了羌活-独活治疗KOA的合理性，为羌活-独活治疗KOA提供了理论依据和新的方向。